Dnmt2 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-402709-LAC

TRDMT1 codifica Dnmt2 (nota anche come TRDMT1), una metiltransferasi dell’RNA citosina-5 evolutivamente conservata che metila prevalentemente i tRNA in C38, influenzando la stabilità dei tRNA, la fedeltà di decodifica e la traduzione in risposta allo stress. Attraverso la metilazione dell’RNA e una più ampia regolazione epitranscrittomica, Dnmt2 contribuisce alla proteostasi, all’adattamento cellulare allo stress ossidativo e genotossico e al mantenimento dell’integrità dell’RNA. Un’alterata attività di TRDMT1 è stata studiata in contesti di traduzione e segnalazione dello stress deregolate, inclusa la biologia del cancro e altri disturbi in cui le vie di modifica dell’RNA e il controllo traduzionale risultano compromessi. Queste caratteristiche rendono TRDMT1 un bersaglio utile per studiare i programmi di espressione genica dipendenti dalle modifiche dell’RNA e i fenotipi cellulari a valle.

Le particelle di attivazione lentivirale Dnmt2 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di TRDMT1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Dnmt2 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione TRDMT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Dnmt2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo TRDMT1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.