DNA Ligase III Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402841-ACT

Il gene umano **LIG3** codifica la **DNA ligasi III**, una ligasi ATP-dipendente essenziale per sigillare le rotture a singolo filamento del DNA durante la riparazione per escissione di basi e per risolvere intermedi di riparazione nell’end joining alternativo. Grazie ai suoi ruoli nucleari e mitocondriali, la DNA ligasi III supporta l’integrità del genoma, il mantenimento del DNA mitocondriale e la sopravvivenza cellulare in condizioni di stress ossidativo e di stress associato alla replicazione. L’attività di LIG3 interseca complessi di riparazione associati a PARP1 e XRCC1 e influenza gli esiti mutazionali quando la ricombinazione omologa è limitata. Un’espressione deregolata di LIG3 o la dipendenza da meccanismi di riparazione mediati da LIG3 è stata collegata a fenotipi di instabilità genomica rilevanti per la biologia del cancro e per modelli di malattie neurodegenerative.

DNA Ligase III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LIG3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA Ligase III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LIG3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LIG3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA Ligase III. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LIG3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA Ligase III nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA Ligase III nelle cellule tumorali con espressione di LIG3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.