DDX30 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411632-ACT

DHX30 (DDX30) codifica un’elicasi dell’RNA della famiglia DEAD-box ATP-dipendente che modula la struttura secondaria dell’RNA per supportare il metabolismo dell’RNA, inclusi aspetti della regolazione trascrizionale, della maturazione/processing dell’RNA e della traduzione. In quanto elicasi, DDX30 contribuisce al rimodellamento dei complessi ribonucleoproteici e ai processi di controllo qualità dell’RNA che influenzano le risposte cellulari allo stress e i programmi di espressione genica mitocondriali e citosolici. Un’alterazione dell’attività delle elicasi dell’RNA può perturbare la proteostasi e le reti di segnalazione dell’immunità innata attraverso effetti sul sensing dell’RNA e sul destino dei trascritti. La disregolazione di DHX30 è stata associata a fenotipi del neurosviluppo e a cambiamenti trascrittomici più ampi rilevanti per la malattia, rendendolo un nodo utile per studiare meccanismi incentrati sull’RNA nelle cellule umane.

DDX30 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DHX30 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DDX30 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DHX30 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DHX30, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DDX30. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DHX30 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DDX30 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DDX30 nelle cellule tumorali con espressione di DHX30 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.