DAP12 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400916-ACT

TYROBP codifica la proteina 12 attivatrice di DNAX (DAP12), un adattatore transmembrana contenente un motivo ITAM che collega i recettori attivatori presenti sulle cellule mieloidi e linfoidi alla segnalazione a valle. DAP12 si associa a recettori come TREM2, SIRPβ1 e ad alcuni recettori delle cellule NK per favorire la fosforilazione di SYK/ZAP70 e attivare le vie PI3K, MAPK e NF-κB, che regolano fagocitosi, produzione di citochine, burst ossidativo e sopravvivenza cellulare. Nella microglia e nei macrofagi, la segnalazione dipendente da TYROBP modella l’attivazione dell’immunità innata, la gestione dei lipidi e la rimozione dei detriti cellulari, collegandola ai processi neuroinfiammatori e alla disregolazione immunitaria. Alterazioni della segnalazione TYROBP/DAP12 sono state associate a fenotipi infiammatori e legati alla neurodegenerazione, rendendola un bersaglio utile per studiare le reti di segnalazione recettore–adattatore nelle cellule immunitarie umane.

DAP12 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TYROBP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DAP12 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TYROBP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TYROBP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DAP12. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TYROBP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DAP12 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DAP12 nelle cellule tumorali con espressione di TYROBP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.