DAP10 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402426-ACT

HCST codifica per la DNAX activation protein 10 (DAP10), un adattatore transmembrana che collega NKG2D e recettori correlati alla segnalazione intracellulare nei linfociti citotossici umani. Attraverso il suo motivo YINM, DAP10 recluta PI3K e Grb2/Vav1 per promuovere l’attivazione delle vie di Akt e MAPK, supportando la formazione della sinapsi immunologica, la produzione di citochine e la citotossicità mediata dalle cellule. Questo asse di segnalazione regola la sorveglianza, da parte delle cellule NK e dei linfociti T CD8⁺, di cellule stressate, infette o trasformate e influenza il crosstalk infiammatorio all’interno del microambiente tumorale. Un’attività disregolata di HCST/DAP10 è stata implicata in alterazioni delle risposte immunitarie innate e adattative rilevanti per l’immunobiologia dei tumori, le infezioni virali e l’infiammazione autoimmune.

DAP10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HCST senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DAP10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HCST nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HCST, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DAP10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HCST nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DAP10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DAP10 nelle cellule tumorali con espressione di HCST silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.