Cytokeratin 14 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400362-ACT

KRT14 codifica per la citocheratina 14, una proteina dei filamenti intermedi di tipo I che forma un eterodimero con la cheratina 5 per costituire la rete cheratinica basale negli epiteli stratificati. Questo impalcato citoscheletrico sostiene la resistenza meccanica, l’adesione cellula-cellula e la differenziazione epiteliale, e interagisce con nodi di segnalazione quali i complessi integrina/emi-desmosoma e le risposte allo stress regolate dal citoscheletro. Un’espressione o una funzione alterata di KRT14 è associata a fenotipi di fragilità epidermica e a una cheratinizzazione disregolata, ed è spesso utilizzato come marcatore di stati epiteliali di tipo basale nella cute e nei tessuti ghiandolari. In biologia del cancro e nei modelli di rimodellamento tissutale, i programmi associati a KRT14 vengono studiati in relazione alla plasticità epiteliale, ai fenotipi legati all’invasione e all’adattamento allo stress del microambiente.

Cytokeratin 14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cytokeratin 14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cytokeratin 14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cytokeratin 14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cytokeratin 14 nelle cellule tumorali con espressione di KRT14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.