cystatin D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405049-ACT

CST5 codifica la cistatina D, una cistatina di tipo 2 secreta che inibisce le proteasi cisteiniche papaina-simili, come le catepsine, contribuendo a regolare la proteolisi extracellulare e intracellulare. Modulando l’attività proteasica, la cistatina D partecipa all’omeostasi epiteliale, al rimodellamento della matrice extracellulare, alla processazione dell’antigene e alla segnalazione infiammatoria che può influenzare la differenziazione cellulare e la funzione di barriera. Alterazioni dell’espressione di CST5 e uno squilibrio catepsine–cistatine sono stati riportati in contesti di biologia tumorale, infiammazione mucosale e rimodellamento tissutale, rendendolo rilevante per lo studio della proteostasi e della regolazione del microambiente. In quanto proteina umana espressa in diversi compartimenti epiteliali, la cistatina D è spesso studiata nei pathway che controllano la proteolisi associata all’invasione e i programmi trascrizionali responsivi allo stress.

cystatin D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CST5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cystatin D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CST5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CST5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cystatin D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CST5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cystatin D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cystatin D nelle cellule tumorali con espressione di CST5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.