CYP3A5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401306-ACT

CYP3A5 codifica una monoossigenasi del citocromo P450 che contribuisce al metabolismo ossidativo di steroidi endogeni e xenobiotici, modulando l’esposizione cellulare a composti bioattivi e ai loro metaboliti. Come parte della sottofamiglia CYP3A, CYP3A5 partecipa al trasferimento di elettroni NADPH-dipendente tramite la reduttasi del citocromo P450 e influisce sull’omeostasi lipidica, sulla segnalazione ormonale e sulle risposte allo stress cellulare attraverso una regolazione mediata dai metaboliti. L’espressione è dipendente dal tessuto e dal genotipo, con un’attività rilevante in fegato e rene che contribuisce alla variabilità interindividuale della capacità metabolica. Un’espressione o una funzione disregolata di CYP3A5 è stata associata ad alterazioni della farmacocinetica e a una maggiore suscettibilità a patofisiologie metaboliche e renali, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici delle vie di detossificazione.

CYP3A5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CYP3A5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CYP3A5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CYP3A5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CYP3A5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CYP3A5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CYP3A5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CYP3A5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CYP3A5 nelle cellule tumorali con espressione di CYP3A5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.