Csk Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400992-ACT

Il gene umano **CSK** codifica per **Csk**, una tirosin-chinasi citosolica non recettoriale che regola negativamente le chinasi della famiglia Src fosforilando la tirosina inibitoria C-terminale, limitando così la trasduzione del segnale proveniente da recettori immunitari, integrine e vie dei fattori di crescita. Attraverso questo ruolo di “gatekeeper”, Csk modella i programmi a valle MAPK/ERK, PI3K–AKT e di rimodellamento del citoscheletro, influenzando adesione, migrazione e le soglie di attivazione cellulare. Alterazioni dell’attività o della regolazione di CSK sono state associate a una deregolazione del segnale immunitario e a fenotipi infiammatori, e il gene viene spesso studiato in contesti in cui reti di fosforilazione guidate da Src contribuiscono a proliferazione e invasività aberranti. In quanto modulatore centrale della segnalazione delle chinasi della famiglia Src, Csk è rilevante per analisi a livello di sistema dei circuiti di fosforilazione su tirosina e della loro associazione con stati di segnalazione legati ad autoimmunità e cancro.

Csk Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CSK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Csk Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CSK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CSK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Csk. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CSK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Csk nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Csk nelle cellule tumorali con espressione di CSK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.