CRSP70 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402381-ACT

MED26 codifica CRSP70, una subunità centrale del complesso Mediator che collega i fattori di trascrizione specifici di sequenza alla RNA polimerasi II e contribuisce a coordinare l’inizio della trascrizione con l’elongazione. Interagendo con il modulo CDK8 e con il super elongation complex, MED26 favorisce il rilascio dalla pausa prossimale al promotore e la regolazione dinamica di programmi di espressione genica coinvolti nell’identità cellulare e nelle risposte allo stress. Un’alterata funzione di Mediator, inclusa la disregolazione delle reti trascrizionali associate a MED26, è rilevante negli studi sui disturbi dello sviluppo e sul rimodellamento trascrizionale associato al cancro. In quanto regolatore nucleare della trascrizione mediata da Pol II, CRSP70 è spesso oggetto di analisi a livello di pathway della comunicazione enhancer–promotore, del controllo genico dipendente dalla cromatina e dell’accoppiamento segnale-trascrizione specifico del contesto.

CRSP70 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MED26 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CRSP70 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MED26 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MED26, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CRSP70. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MED26 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CRSP70 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CRSP70 nelle cellule tumorali con espressione di MED26 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.