CRIM1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424480-ACT

Crim1 codifica per il “cysteine rich transmembrane BMP regulator 1” (CRIM1), una proteina transmembrana di tipo I che si lega ai fattori di crescita secreti e ne modula la maturazione, il traffico intracellulare e la disponibilità per la segnalazione, inclusi i membri della superfamiglia BMP/TGF-β. Nei tessuti murini, CRIM1 contribuisce a programmi di sviluppo quali l’angiogenesi e la morfogenesi degli organi, modellando i gradienti extracellulari dei ligandi e le successive risposte trascrizionali dipendenti da SMAD. È inoltre implicata nelle interazioni cellula–cellula e cellula–matrice che influenzano il comportamento di cellule epiteliali ed endoteliali, collegandola a vie che controllano proliferazione, differenziamento e organizzazione dei tessuti. Un’attività di CRIM1 deregolata è stata associata a fenotipi rilevanti per difetti dello sviluppo e per stati di segnalazione legati a fibrosi e cancro, rendendola un nodo utile per studi meccanicistici della segnalazione dei fattori di crescita.

CRIM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Crim1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CRIM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Crim1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Crim1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CRIM1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Crim1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CRIM1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CRIM1 nelle cellule tumorali con espressione di Crim1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.