CRABP-I Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-405485-ACT-2

Il gene umano CRABP1 codifica la cellular retinoic acid–binding protein I (CRABP-I), un vettore citosolico ad alta affinità che funge da tampone e trasporta l’acido retinoico all-trans, modulandone la disponibilità per la segnalazione dipendente dai retinoidi. Regolando la distribuzione e il metabolismo dell’acido retinoico, CRABP-I influenza programmi trascrizionali governati dai recettori dell’acido retinoico e si integra con vie che controllano la differenziazione cellulare, la proliferazione e la definizione dei pattern di sviluppo. Alterazioni dell’espressione di CRABP1 o della gestione dei retinoidi sono implicate nella deregolazione della segnalazione dell’AR osservata in diversi tumori e in contesti neuroevolutivi o neurodegenerativi, nei quali l’omeostasi dei retinoidi incide sul destino cellulare e sulle risposte allo stress. Gli strumenti di gene editing di CRABP1 consentono studi meccanicistici sulle dinamiche di trasporto dei retinoidi, sui trascrittomi responsivi all’AR e sul crosstalk tra vie di segnalazione in modelli cellulari umani pertinenti.

CRABP-I Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CRABP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CRABP-I Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CRABP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CRABP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CRABP-I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CRABP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CRABP-I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CRABP-I nelle cellule tumorali con espressione di CRABP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.