CPTI Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401811-ACT

Il gene umano **CPT1A** codifica la carnitina palmitoiltransferasi 1A (CPTI), un enzima limitante la velocità localizzato sulla membrana mitocondriale esterna che controlla l’ingresso degli acidi grassi a catena lunga nei mitocondri per la β-ossidazione. Regolando la formazione di acil-carnitine, CPTI integra la richiesta energetica cellulare con il catabolismo lipidico e collega il sensing dei nutrienti al metabolismo ossidativo mitocondriale. L’attività di CPT1A influenza vie che includono l’ossidazione degli acidi grassi, la chetogenesi e le risposte allo stress metabolico, e un’alterata regolazione è stata associata a dislipidemia, insulino-resistenza e disfunzione metabolica epatica. In quanto nodo chiave del flusso lipidico mitocondriale, CPT1A è spesso studiato in contesti di rimodellamento metabolico e omeostasi energetica nelle cellule umane.

CPTI Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CPT1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CPTI Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CPT1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CPT1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CPTI. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CPT1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CPTI nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CPTI nelle cellule tumorali con espressione di CPT1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.