COL3A1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419742-ACT

Il gene murino Col3a1 codifica la proteina fibrillare della matrice extracellulare COL3A1 (collagene di tipo III), un importante componente strutturale dei tessuti connettivi che sostiene la resistenza alla trazione e l’elasticità tissutale. COL3A1 è prodotta principalmente dai fibroblasti e da altre cellule mesenchimali ed è integrata nella fibrillogenesi del collagene insieme ad altri collagene interstiziali, contribuendo all’organizzazione della matrice e alla segnalazione biomeccanica. La sua espressione è regolata durante lo sviluppo e in risposta al danno, dove contribuisce alla riparazione delle ferite, al rimodellamento dello stroma e alla deposizione fibrotica della matrice extracellulare. Un’attività deregolata di Col3a1 è frequentemente analizzata in modelli di fibrosi, di anomalie vascolari e dermiche del tessuto connettivo e di rimodellamento dello stroma associato ai tumori.

COL3A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Col3a1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COL3A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Col3a1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Col3a1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COL3A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Col3a1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COL3A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COL3A1 nelle cellule tumorali con espressione di Col3a1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.