CNTF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402471-ACT

Il CNTF umano (fattore neurotrofico ciliare) è una citochina secreta della famiglia dell’IL-6 che supporta la sopravvivenza neuronale, la differenziazione e le risposte allo stress nel sistema nervoso centrale e periferico. Il CNTF segnala principalmente attraverso il complesso recettoriale CNTFRα/LIFR/gp130 per attivare le vie JAK/STAT, con un ulteriore coinvolgimento delle cascate MAPK/ERK e PI3K/AKT che influenzano la crescita dei neuriti, la biologia della glia e il crosstalk infiammatorio. Alterazioni dell’espressione del CNTF e dell’attività della sua via di segnalazione sono state studiate nella neurodegenerazione, nelle lesioni retiniche e in contesti demielinizzanti o neuropatici, in cui il supporto trofico e la gliosi reattiva contribuiscono a plasmare i fenotipi associati alla malattia. Modelli in vitro e in vivo utilizzano la perturbazione del CNTF per indagare i programmi di neuroprotezione, le interazioni neurone–glia e le reti trascrizionali legate alla rigenerazione e allo stress metabolico.

CNTF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CNTF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CNTF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CNTF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CNTF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CNTF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CNTF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CNTF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CNTF nelle cellule tumorali con espressione di CNTF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.