CNTF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402471-ACT

Humanes CNTF (ciliary neurotrophic factor) ist ein sezerniertes Zytokin aus der IL-6-Familie, das das Überleben von Neuronen, deren Differenzierung sowie Stressantworten im zentralen und peripheren Nervensystem unterstützt. CNTF signalisiert vorwiegend über den CNTFRα/LIFR/gp130-Rezeptorkomplex und aktiviert dabei JAK/STAT-Signalwege; zusätzlich werden MAPK/ERK- und PI3K/AKT-Signale eingebunden, die das Neuritenauswachsen, die Glia-Biologie und entzündliche Crosstalk-Mechanismen beeinflussen. Veränderte CNTF-Expression und Aktivität dieser Signalwege wurden in Zusammenhängen wie Neurodegeneration, Netzhautverletzung sowie demyelinisierenden oder neuropathischen Zuständen untersucht, in denen trophische Unterstützung und reaktive Gliosen krankheitsassoziierte Phänotypen prägen. In vitro- und in vivo-Modelle nutzen CNTF-Interventionen, um Neuroprotektionsprogramme, Neuron-Glia-Interaktionen und transkriptionelle Netzwerke zu untersuchen, die mit Regeneration und metabolischem Stress verknüpft sind.

CNTF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CNTF-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CNTF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CNTF-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CNTF-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CNTF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CNTF-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CNTF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CNTF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CNTF-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.