ChoK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403793-ACT

Il gene umano **CHKA** codifica la **colina chinasi alfa** (ChoK), l’enzima ATP-dipendente che catalizza la fosforilazione della colina a **fosfocolina**, una tappa limitante della velocità nella via di **Kennedy** per la biosintesi della **fosfatidilcolina**. Attraverso il controllo dei pool di fosfocolina e della produzione di fosfolipidi di membrana, ChoK sostiene la biogenesi delle membrane cellulari, la segnalazione lipidica e il rimodellamento metabolico associato alla proliferazione e alle risposte allo stress. L’attività di CHKA si interseca con programmi di segnalazione oncogenica e con le alterazioni del metabolismo della colina osservate in molteplici tipi di tumore, ed è stata inoltre implicata in contesti infiammatori e neurodegenerativi tramite una più ampia regolazione dell’omeostasi dei fosfolipidi. In quanto nodo metabolico che collega l’utilizzo dei nutrienti alla dinamica delle membrane, CHKA è frequentemente studiato in vie che governano la crescita cellulare, la migrazione e la funzione degli organelli.

ChoK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHKA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ChoK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHKA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHKA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ChoK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHKA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ChoK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ChoK nelle cellule tumorali con espressione di CHKA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.