CHMP4B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401802-ACT

Il gene umano **CHMP4B** codifica un componente centrale del complesso **ESCRT-III**, che polimerizza sulle membrane endosomiali per promuovere la costrizione e la scissione di membrana durante la biogenesi dei corpi multivescicolari. Attraverso il traffico dipendente da ESCRT, CHMP4B contribuisce a regolare la down-regulation dei recettori, il loro indirizzamento ai lisosomi e il turnover dei complessi di segnalazione, influenzando vie legate alla segnalazione dei fattori di crescita e all’omeostasi cellulare. L’attività di ESCRT-III supporta inoltre le fasi tardive dell’abscissione citocinetica e contribuisce alla riformazione dell’involucro nucleare e alla riparazione della membrana plasmatica. La disregolazione dei componenti ESCRT, incluso CHMP4B, è stata associata ad alterazioni delle dinamiche endolisosomiali ed è rilevante per ricerche su neurodegenerazione, segnalazione nelle cellule tumorali e meccanismi di gemmazione virale.

CHMP4B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHMP4B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CHMP4B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHMP4B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHMP4B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CHMP4B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHMP4B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CHMP4B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CHMP4B nelle cellule tumorali con espressione di CHMP4B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.