Cdk5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400161-ACT

CDK5 codifica la chinasi ciclina‑dipendente 5 (Cdk5), una chinasi serina/treonina diretta verso residui di prolina, attivata principalmente dai cofattori non ciclinici p35 (CDK5R1) e p39 (CDK5R2). Cdk5 regola lo sviluppo e la funzione neuronale controllando la dinamica del citoscheletro, la guida assonale, il traffico delle vescicole sinaptiche e la segnalazione dipendente dall’attività, con effetti a valle su reti di fosforilazione che modellano la neuroplasticità. Al di fuori del sistema nervoso, CDK5 contribuisce alla migrazione cellulare, all’adesione e alle risposte allo stress tramite interazioni con vie quali la segnalazione MAPK, la segnalazione delle adesioni focali e la regolazione di programmi trascrizionali. Un’attività di Cdk5 deregolata e pattern alterati di fosforilazione dei substrati sono stati collegati a meccanismi di malattie neurodegenerative e neuropsichiatriche e vengono anche studiati in modelli di motilità e invasione delle cellule tumorali.

Cdk5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDK5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdk5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDK5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDK5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdk5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDK5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdk5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdk5 nelle cellule tumorali con espressione di CDK5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.