CD223 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406616-ACT

LAG3 (CD223) è un recettore inibitorio di checkpoint immunitario espresso principalmente su cellule T attivate, cellule T regolatorie, cellule NK e su alcuni sottotipi di cellule dendritiche, dove modula l’attivazione e la funzione effettrice guidate dall’antigene. Legandosi alle molecole MHC di classe II e a ligandi correlati, CD223 attenua la segnalazione del TCR e contribuisce alla tolleranza periferica, ai programmi di esaurimento delle cellule T e alla regolazione della produzione di citochine. L’attività di LAG3 interseca vie che governano l’organizzazione della sinapsi immunologica, le reti di co-stimolazione/checkpoint e gli stati trascrizionali infiammatori. Una segnalazione CD223 disregolata è stata implicata nell’esaurimento immunitario associato a infezioni croniche, nei contesti di evasione immunitaria tumorale e nell’infiammazione autoimmune, rendendolo un bersaglio rilevante per studi di immunologia meccanicistica.

CD223 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LAG3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD223 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LAG3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LAG3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD223. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LAG3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD223 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD223 nelle cellule tumorali con espressione di LAG3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.