CD223 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406616-ACT

LAG3 (CD223) ist ein inhibitorischer Immun-Checkpoint-Rezeptor, der vor allem auf aktivierten T-Zellen, regulatorischen T-Zellen, NK-Zellen sowie auf einigen Subtypen dendritischer Zellen exprimiert wird und dort die antigengetriebene Aktivierung und Effektor-Funktion moduliert. Durch die Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle und verwandte Liganden dämpft CD223 die TCR-Signalübertragung und trägt zur peripheren Toleranz, zu Programmen der T‑Zell-Erschöpfung sowie zur Regulation der Zytokinproduktion bei. Die LAG3-Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen, die die Organisation der Immunsynapse, kostimulatorische/Checkpoint-Netzwerke und inflammatorische transkriptionelle Zustände steuern. Eine fehlregulierte CD223-Signalgebung wird mit immunologischer Erschöpfung im Kontext chronischer Infektionen, Tumor-assoziierter Immunflucht und autoimmuner Entzündung in Verbindung gebracht, was sie zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien in der Immunologie macht.

CD223 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LAG3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD223 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LAG3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LAG3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD223-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LAG3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD223-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD223-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LAG3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.