CCDC89 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408069-ACT

CCDC89 (coiled-coil domain containing 89) codifica una proteina coiled-coil prevista, implicata nell’organizzazione del citoscheletro e in reti di interazioni proteina–proteina che sostengono l’architettura e la segnalazione intracellulari. Le proteine coiled-coil partecipano spesso a funzioni di impalcatura (scaffolding) che influenzano il posizionamento degli organelli, il traffico vescicolare e le vie di risposta allo stress, suggerendo che CCDC89 possa modulare il coordinamento spaziale dei processi cellulari. Associazioni a livello di espressione e di varianti riportate in diversi dataset genomici indicano una potenziale rilevanza di CCDC89 per programmi trascrizionali deregolati osservati in contesti proliferativi e neurobiologici, motivando studi meccanicistici in modelli cellulari pertinenti alla malattia. Definire come CCDC89 influisca sul cablaggio delle vie di segnalazione può chiarire gli effetti a valle sulle transizioni di stato cellulare, sui fenotipi di adesione/motilità e sulla proteostasi.

CCDC89 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCDC89 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CCDC89 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCDC89 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCDC89, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CCDC89. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCDC89 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CCDC89 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CCDC89 nelle cellule tumorali con espressione di CCDC89 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.