casein kinase Iγ1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404681-ACT

CSNK1G1 codifica la caseina chinasi Iγ1, una chinasi serina/treonina associata alla membrana appartenente alla famiglia CK1, che modula la segnalazione dipendente dalla fosforilazione e il turnover proteico. Le isoforme CK1 regolano molteplici processi, tra cui il traffico dei recettori, il ritmo circadiano e la segnalazione in risposta allo stress, e intersecano vie come Wnt/β-catenina, Hedgehog e le risposte al danno del DNA attraverso la fosforilazione di componenti chiave delle rispettive vie. Modellando la dinamica della segnalazione fosforilativa alle membrane e all’interno di complessi citosolici, CSNK1G1 influenza il controllo del ciclo cellulare, la polarità e i circuiti di feedback omeostatici. Un’attività CK1 deregolata è stata collegata a una segnalazione proliferativa alterata e ad altri fenotipi rilevanti per la malattia, rendendo CSNK1G1 utile per studi meccanicistici sul rimodellamento delle vie guidato dalle chinasi.

casein kinase Iγ1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CSNK1G1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

casein kinase Iγ1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CSNK1G1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CSNK1G1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di casein kinase Iγ1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CSNK1G1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da casein kinase Iγ1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via casein kinase Iγ1 nelle cellule tumorali con espressione di CSNK1G1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.