CARP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401842-ACT

L’ANKRD1 umano codifica la Cardiac Ankyrin Repeat Protein (CARP), un cofattore trascrizionale sensibile allo stress, arricchito nel muscolo striato, che trasloca tra il sarcomero e il nucleo. CARP integra segnali meccanici e ipertrofici modulando programmi di espressione genica legati all’organizzazione del sarcomero, al rimodellamento del citoscheletro e allo sviluppo del muscolo cardiaco, incluse interazioni con regolatori trascrizionali come le vie di segnalazione associate a YAP/TEAD e NF-κB. Un’alterata espressione di ANKRD1/CARP è stata associata al rimodellamento correlato alle cardiomiopatie e a fenotipi più ampi di stress muscolare, rendendola un bersaglio utile per analizzare la meccanotrasduzione e l’adattamento trascrizionale. Modelli in vitro che sfruttano la perturbazione di ANKRD1 sono comunemente impiegati per studiare reti geniche contrattili, l’integrità miofibrillare e cambiamenti trascrittomici indotti dallo stress.

CARP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ANKRD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CARP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ANKRD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ANKRD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CARP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ANKRD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CARP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CARP nelle cellule tumorali con espressione di ANKRD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.