CaMKI Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401136-ACT

O CAMK1 humano codifica a CaMKI, uma quinase de serina/treonina dependente de cálcio/calmodulina que converte sinais intracelulares de Ca2+ em eventos de fosforilação que controlam programas transcricionais, a dinâmica do citoesqueleto e a progressão do ciclo celular. A CaMKI integra-se a redes de sinalização de Ca2+/CaM e pode acoplar a atividade neuronal à expressão gênica por meio de cascatas de quinases a jusante e de vias ligadas ao CREB, apoiando o crescimento de neuritos e processos relacionados à plasticidade sináptica. Para além do sistema nervoso, a atividade de CAMK1 tem sido implicada em contextos de sinalização mais amplos que influenciam a proliferação e respostas ao estresse, o que a torna relevante para estudos mecanísticos da desregulação de sinalização observada em doenças complexas. Alterações na sinalização de quinases dependentes de Ca2+ são frequentemente associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos, bem como à reprogramação de vias associadas ao câncer, posicionando CAMK1 como um nó útil para a investigação de vias.

CaMKI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CAMK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CaMKI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CAMK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CAMK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CaMKI. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CAMK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CaMKI no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CaMKI em células tumorais com expressão de CAMK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.