BUB1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402006-ACT

BUB1 codifica una chinasi serina/treonina che funge da componente centrale del checkpoint di assemblaggio del fuso, coordinando il corretto allineamento e la segregazione dei cromosomi durante la mitosi. Si localizza ai cinetocori e contribuisce al reclutamento e alla regolazione di proteine del checkpoint, tra cui BUB3, MAD1/2 e CDC20, per controllare l’inizio dell’anafase e mantenere la stabilità genomica. Attraverso il suo ruolo nell’attacco cinetocoro–microtubulo e nella segnalazione del checkpoint, BUB1 collega la tempistica mitotica alle vie di correzione degli errori che prevengono l’aneuploidia. Un’espressione o attività deregolata di BUB1 è stata associata a fenotipi di instabilità cromosomica osservati in diversi modelli di cancro, rendendolo un nodo utile per studiare il controllo mitotico, la proliferazione e i meccanismi di mantenimento del genoma.

BUB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BUB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BUB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BUB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BUB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BUB1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BUB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BUB1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BUB1 nelle cellule tumorali con espressione di BUB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.