BETA 3 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-425594-ACT-2

Il gene murino Bhlhe22 codifica il fattore di trascrizione basic helix–loop–helix (bHLH) BETA3, un regolatore della differenziazione e della maturazione neuronale che contribuisce a plasmare i programmi di espressione genica durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale. BETA3 modula reti trascrizionali legate alla specificazione del destino cellulare, alla crescita dei neuriti e all’organizzazione sinaptica attraverso il legame al DNA mediato dal dominio bHLH e l’interazione con vie di segnalazione dello sviluppo che coordinano le transizioni da progenitore a neurone. Un’attività alterata di Bhlhe22 è stata associata in letteratura a una compromissione dei circuiti corticali e a fenotipi neuroevolutivi, rendendolo rilevante per lo studio dei meccanismi alla base dello sviluppo cerebrale e della biologia delle malattie neurologiche. L’editing genetico di Bhlhe22 in modelli murini consente di interrogare in modo funzionale le decisioni di linea, l’assemblaggio dei circuiti e le conseguenti variazioni trascrittomiche in neuroni primari, organoidi o in contesti di sviluppo in vivo.

BETA 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Bhlhe22 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BETA 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Bhlhe22 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Bhlhe22, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BETA 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Bhlhe22 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BETA 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BETA 3 nelle cellule tumorali con espressione di Bhlhe22 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.