B7-H4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416865-ACT

VTCN1 codifica la proteina checkpoint immunitario B7-H4 (nota anche come VTCN1), un ligando della famiglia B7 che modula l’attivazione delle cellule T e la produzione di citochine per limitare le risposte immunitarie. B7-H4 è in genere espressa a bassi livelli nella maggior parte dei tessuti normali, ma può essere indotta in specifici contesti cellulari ed è frequentemente associata a programmi immunoregolatori nei compartimenti epiteliale e mieloide. La sua espressione si integra con le reti di segnalazione infiammatoria e di presentazione dell’antigene che influenzano la funzione dei linfociti e l’omeostasi immunitaria dei tessuti. La disregolazione di VTCN1/B7-H4 è stata associata all’elusione immunitaria tumorale e a pattern alterati di infiltrazione immunitaria, rendendola rilevante per studi meccanicistici in immunologia del cancro e dell’infiammazione.

B7-H4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VTCN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

B7-H4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VTCN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VTCN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di B7-H4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VTCN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da B7-H4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via B7-H4 nelle cellule tumorali con espressione di VTCN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.