B7-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401971-ACT

Il CD80 umano (B7-1) è un ligando costimolatorio della superfamiglia delle immunoglobuline, espresso principalmente sulle cellule presentanti l’antigene, dove si lega a CD28 e CTLA-4 sulle cellule T per modulare l’attivazione, la proliferazione e la produzione di citochine. Influenzando la formazione della sinapsi immunologica e integrando segnali che completano l’ingaggio del TCR, B7-1 condiziona le vie a valle che controllano la differenziazione effettrice e la tolleranza periferica. Un’espressione deregolata di CD80 è implicata in un’attivazione immunitaria aberrante e in meccanismi di tolleranza compromessi osservati in diverse patologie autoimmuni e infiammatorie, ed è spesso valutata in immunologia dei tumori come determinante della capacità di presentazione dell’antigene. In vitro, CD80 rappresenta un marcatore chiave e un nodo funzionale negli studi sulla maturazione delle cellule dendritiche, sulla polarizzazione dei macrofagi e sul priming delle cellule T.

B7-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD80 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

B7-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD80 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD80, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di B7-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD80 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da B7-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via B7-1 nelle cellule tumorali con espressione di CD80 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.