Ataxin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403309-ACT

ATXN1 codifica l’atassina-1, una proteina prevalentemente nucleare che partecipa alla regolazione trascrizionale e a processi associati all’RNA attraverso interazioni con la cromatina e con partner leganti l’RNA. L’atassina-1 contribuisce ai programmi di espressione genica neuronali e dello sviluppo ed è collegata alle vie dell’omeostasi proteica, inclusi il turnover dipendente dall’ubiquitina e la compartimentalizzazione subnucleare. Alterazioni del dosaggio o della funzione di ATXN1 possono perturbare le reti trascrizionali e le risposte cellulari allo stress, e il gene è ampiamente studiato nel contesto della neurodegenerazione, in particolare dell’atassia spinocerebellare associata alle poliglutamine. Nei modelli cellulari umani, ATXN1 rappresenta un nodo facilmente manipolabile per analizzare i circuiti di regolazione genica, i meccanismi di proteostasi e la vulnerabilità specifica dei diversi tipi cellulari.

Ataxin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATXN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ataxin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATXN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATXN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ataxin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATXN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ataxin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ataxin-1 nelle cellule tumorali con espressione di ATXN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.