ASPP1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423473-ACT

Il gene murino **Ppp1r13b** codifica **ASPP1**, un regolatore conservato della famiglia di **p53** che potenzia programmi trascrizionali specifici di sequenza che controllano l’apoptosi, l’arresto del ciclo cellulare e le risposte al danno al DNA. ASPP1 modula l’equilibrio tra segnali pro-sopravvivenza e pro-morte influenzando la selezione dei geni bersaglio di p53, p63 e p73 e coopera con vie sensibili allo stress che plasmano l’omeostasi e la differenziazione epiteliale. Attraverso queste funzioni, un’attività alterata di ASPP1 è rilevante in modelli sperimentali di soppressione tumorale, instabilità genomica e rimodellamento dipendente dal contesto delle decisioni di destino cellulare. Ppp1r13b costituisce quindi un nodo utile per analizzare i meccanismi di controllo trascrizionale che collegano il rilevamento dello stress cellulare alla morte cellulare programmata.

ASPP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ppp1r13b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASPP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ppp1r13b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ppp1r13b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASPP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ppp1r13b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASPP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASPP1 nelle cellule tumorali con espressione di Ppp1r13b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.