APOBEC3G Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402769-ACT

APOBEC3G umano è una deaminasi della citidina che limita retrovirus e retrotrasposoni introducendo modifiche da C a U nel DNA a singolo filamento durante la trascrizione inversa, promuovendo una mutagenesi letale dei genomi virali. Agisce nell’ambito dell’immunità innata intrinseca e interseca i programmi genici indotti dall’interferone e le vie di sensing degli acidi nucleici che modellano la difesa antivirale. L’attività di APOBEC3G è contrastata da antagonisti virali come Vif di HIV-1, rendendone la regolazione centrale negli studi sulle interazioni ospite–patogeno e sull’evoluzione virale. Un’attività deregolata delle deaminasi della famiglia APOBEC è stata inoltre collegata a instabilità genomica e a firme mutazionali rilevanti per la biologia del cancro e per contesti infiammatori.

APOBEC3G Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di APOBEC3G senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

APOBEC3G Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus APOBEC3G nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione APOBEC3G, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di APOBEC3G. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus APOBEC3G nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da APOBEC3G nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via APOBEC3G nelle cellule tumorali con espressione di APOBEC3G silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.