ANO1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401314-ACT

ANO1 (noto anche come TMEM16A) codifica un canale del cloruro attivato dal Ca2+ che regola la secrezione di fluidi negli epiteli, l’eccitabilità della muscolatura liscia delle vie aeree e del tratto gastrointestinale e la dinamica del potenziale di membrana in diversi tipi cellulari. Grazie all’accoppiamento con i segnali intracellulari di Ca2+, ANO1 influenza il trasporto ionico, il controllo del volume cellulare e reti di segnalazione Ca2+-dipendenti che si intersecano con i programmi di proliferazione e migrazione. Un’espressione o un’attività aberrante di ANO1 è stata associata a fenotipi alterati di secrezione epiteliale e a un’eccitabilità deregolata, ed è spesso studiata nel contesto della biologia tumorale, dove il flusso di cloruro può modulare la crescita e il comportamento invasivo. Di conseguenza, ANO1 funge da nodo funzionale che collega la segnalazione del Ca2+ alla conduttanza del cloruro e ai conseguenti cambiamenti dello stato cellulare rilevanti per il rimodellamento associato alle malattie.

ANO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ANO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ANO1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ANO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ANO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ANO1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ANO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ANO1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ANO1 nelle cellule tumorali con espressione di ANO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.