Aminopeptidase A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403989-ACT

ENPEP codifica l’amminopeptidasi A (APA), un’amminopeptidasi di membrana zinco-dipendente che rimuove preferenzialmente residui acidi N-terminali da peptidi bioattivi. Nel sistema renina–angiotensina, APA contribuisce al processamento dell’angiotensina II e influenza la segnalazione a valle legata al tono vascolare e alla regolazione neuroendocrina, con ulteriori ruoli nel metabolismo dei peptidi sulla superficie cellulare. L’espressione di ENPEP è marcata nel rene e in altri compartimenti epiteliali, dove si intreccia con il processamento proteolitico, il traffico di membrana e l’omeostasi locale degli ormoni peptidici. Un’attività di APA o un’espressione di ENPEP deregolate sono state associate ad alterazioni della regolazione della pressione arteriosa e alla fisiopatologia renale, stimolando studi meccanicistici in modelli cellulari cardiometabolici e rilevanti per il rene.

Aminopeptidase A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ENPEP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Aminopeptidase A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ENPEP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ENPEP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Aminopeptidase A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ENPEP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Aminopeptidase A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Aminopeptidase A nelle cellule tumorali con espressione di ENPEP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.