AKR7A2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403377-ACT

AKR7A2 codifica un’aldo-cheto reduttasi citosolica che catalizza la riduzione, dipendente da NADPH, di aldeidi e chetoni reattivi, sostenendo la difesa cellulare contro lo stress elettrofilo e ossidativo. Detossificando aldeidi derivate dalla perossidazione lipidica e metaboliti xenobiotici, AKR7A2 contribuisce all’omeostasi redox e al mantenimento dell’integrità del proteoma cellulare. La sua attività si interseca con le reti di detossificazione delle aldeidi e con vie più ampie di risposta allo stress che influenzano la suscettibilità all’esposizione a sostanze tossiche e la segnalazione infiammatoria. Un’alterata regolazione di AKR7A2 è stata studiata in contesti in cui lo stress carbonilico e il metabolismo degli xenobiotici influenzano fenotipi rilevanti per la malattia, inclusi la disfunzione epatica e stati di stress ossidativo associati ai tumori.

AKR7A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AKR7A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AKR7A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AKR7A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AKR7A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AKR7A2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AKR7A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AKR7A2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AKR7A2 nelle cellule tumorali con espressione di AKR7A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.