ADO Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-408985-ACT-2

L’ADO umano (2-aminoetanotiolo diossigenasi) è un enzima del ferro non eme che catalizza l’ossidazione dipendente dall’ossigeno della cisteamina a ipotaurina, sostenendo la biosintesi cellulare della taurina e, più in generale, il metabolismo degli amminoacidi solforati. Collegando il turnover della cisteamina all’omeostasi redox e al metabolismo mitocondriale, l’attività di ADO si intreccia con vie che regolano le risposte allo stress ossidativo e l’adattamento bioenergetico nei tessuti metabolicamente attivi. La disregolazione dell’equilibrio taurina/ipotaurina e del metabolismo dei tioli è stata implicata in condizioni associate a disfunzione mitocondriale e ad alterata gestione delle specie reattive dell’ossigeno, rendendo ADO un bersaglio utile per studi meccanicistici. L’editing genetico o la perturbazione di ADO consente ai ricercatori di indagare il flusso dei metaboliti derivati dalla cisteamina, la biologia delle diossigenasi ferro-dipendenti e gli effetti a valle sui fenotipi cellulari di stress in pertinenti sistemi modello umani.

ADO Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADO senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ADO Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADO nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADO, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ADO. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADO nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ADO nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ADO nelle cellule tumorali con espressione di ADO silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.