ACSL4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424503-ACT

Il gene murino Acsl4 codifica l’acil-CoA sintetasi della famiglia delle catene lunghe, membro 4 (ACSL4), un enzima associato alla membrana che attiva gli acidi grassi polinsaturi a catena lunga convertendoli in tioesteri acil-CoA, destinati all’incorporazione nei fosfolipidi e alle successive vie del metabolismo lipidico. ACSL4 è un determinante chiave del rimodellamento dei fosfolipidi e della composizione di membrana sensibile al redox, collegando l’utilizzo dei lipidi alle risposte allo stress ossidativo e alla suscettibilità alla ferroptosi. Attraverso la regolazione del metabolismo dell’acido arachidonico e dell’acido adrenico, ACSL4 influenza la segnalazione lipidica infiammatoria, la funzione mitocondriale e la dinamica delle membrane. Alterazioni dell’attività e dell’espressione di ACSL4 sono state associate a patologie guidate dalla perossidazione lipidica e sono state studiate in contesti che includono neurodegenerazione, disfunzioni metaboliche e adattamento allo stress nelle cellule tumorali.

ACSL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Acsl4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ACSL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Acsl4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Acsl4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ACSL4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Acsl4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ACSL4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ACSL4 nelle cellule tumorali con espressione di Acsl4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.