A-Raf Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401799-ACT

L’ARAF umano codifica A-Raf, una chinasi serina/treonina della famiglia RAF che trasmette segnali dipendenti da RAS alla cascata MAPK regolando MEK e, a valle, l’attività di ERK. Attraverso questa via, A-Raf contribuisce al controllo della proliferazione, della differenziazione e della sopravvivenza cellulare e può modulare, in modo dipendente dal contesto, l’intensità e la durata del segnale nei diversi tessuti. Un’attivazione anomala dell’asse RAS–RAF–MEK–ERK è una caratteristica comune della disregolazione oncogenica e dello sviluppo, rendendo ARAF un nodo utile per analizzare il cablaggio della via MAPK, i meccanismi di feedback e il crosstalk con PI3K/AKT e con i programmi di risposta allo stress. La perturbazione sperimentale di ARAF supporta studi meccanicistici sulla compensazione di rete tra i paraloghi RAF e sulle risposte trascrizionali dipendenti dalla via.

A-Raf Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARAF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

A-Raf Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARAF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARAF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di A-Raf. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARAF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da A-Raf nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via A-Raf nelle cellule tumorali con espressione di ARAF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.