β-defensin 124 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410392-ACT

DEFB124 codifica la β-defensina umana 124, un piccolo peptide cationico appartenente alla famiglia delle defensine, che contribuisce all’immunità innata epiteliale attraverso un’attività antimicrobica diretta e la modulazione delle risposte infiammatorie locali. Le β-defensine partecipano ai processi di barriera delle mucose e possono influenzare la segnalazione chemiotattica e le reti di citochine che modellano il reclutamento dei leucociti e le interazioni ospite–microbo. Alterazioni nei pattern di espressione delle defensine sono state associate a una disregolazione dell’immunità mucosale e a stati infiammatori cronici, a sostegno dell’interesse nello studio di DEFB124 nella biologia delle infezioni e nell’omeostasi immunitaria. Nel contesto del tratto riproduttivo e urogenitale, i membri della famiglia delle defensine sono inoltre studiati per il loro ruolo nel mantenimento dell’integrità della barriera e dell’equilibrio del microbioma.

β-defensin 124 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DEFB124 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β-defensin 124 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DEFB124 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DEFB124, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β-defensin 124. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DEFB124 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β-defensin 124 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β-defensin 124 nelle cellule tumorali con espressione di DEFB124 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.