Historia do RNAi

Primeiramente identificados em C.elegans pelos premiados com o premio Nobel, Fire e Mello, RNA de interferencia e uma das descobertas mais promissoras em biologia molecular. A atividade endogena de RNAi tem sido associada com a regulacao da motilidade de transposons, determinacao do perfil de expressao genetica, destino celular, sendo crucial componente na defesa celular inata contra infeccoes viroticas in vivo. Ha 3 mecanimos demonstrados e unicos de interferencia via RNAi para controle de expressao de genes alvos. RNAi regula a transcricao de genes alterando a formacao de heterocromatina. RNAi realiza duas formas de controle pos-transcripcional: 1) inibindo a translacao do mRNA alvo e 2) controlando a destruicao do mRNA alvo atraves do complexo RISC.

A descoberta do RNAi introduziu uma ferramenta laboratorial extraordinaria e poderosa para pesquisadores, a qual se transformou, posteriormente, em uma ferramenta terapeutica com potential promissor, e por isso, finalmente em 2006, os pesquisadores Andrew Z. Fire e Craig C. Mello ganharam o Premio Nobel em Fisiologia e Medicina.Em pesquisas laboratoriais, moleculas de RNAI estao sendo utilizadas para diminuir a expressao genes alvo unicos em diversos organismo e celulas, atraves dos 3 mecanismos de inibicao de expressao genetica descritos acima. Essas tecnicas sao uteis na manipulacao experimental para fins de estudo de genes especificos, funcao proteica e suas inter-relacoes com outros genes e proteinas. RNAi tem sido tambem reconhecido por seu grande potencial para usos clinicos.

Detalhes sobre esses mecanismos de interferencia via RNAi tem sido ampla e rigorosamente estudados, mas ainda ha muito a ser investigado. O controle do processo de RNAi sobre a degradacao do RNA mensageiro (mRNA) atraves do complexo RISC ainda e o mecanismo melhor descrito e tambem o mecanismo mais aceito para os mecanismos de silenciamento genetica via RNAi.

A Santa Cruz Biotechnlogy, Inc. oferece um linha completa de silenciadores geneticos tipo RNAi, incluido, siRNA, plasmideo shRNA e produtos de lentivirus para shRNA englobando mais de 99% dos genes codifadores de proteinas humanas e do camundongo.

A quebra do RNA mensageiro dirigida via RNAi

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Silenciadores Geneticos tipo siRNA Pasmideos shRNA Particulas de Lentivirus shRNA Perguntas frequentes Volta ao inicio

Silenciadores Geneticos tipo siRNA

• O termo siRNA se refere ao pequeno RNA de interferencia ou RNA de interferencia curto
• Exige transfeccao de celulas usando um reagente de transfeccao lipidico
• Util para "knock-down" transitorio

• Silenciadores Geneticos siRNA sao "pools" de tres agentes especificos formados por moleculas de 19-25 nucleotides em fita dupla de RNA com a porcao 2-nt 3' livre em cada extremidade.
• 10 µ M, 50-100 transfeccoes
• Para verificar independentemente resultados de silenciamento de genes alvo, siRNA duplex individuais estarao disponiveis sob pedido.

• Anticorpos controle compativeis estao disponiveis
• RT-PCR Primers estao disponiveis
• siRNA solucao tampao diluida, sc-29527
• siRNA Reagente de Transfeccao, sc-29528
• siRNA Meio para Transfeccao, sc-36868
• siRNA Sistema de Reagentes, sc-45064
• siRNAs controle, incluindo Controle siRNA-A, sc-37007
• Controle siRNA (Conjugato FITC)-A, sc-38869

Como funcionam os silenciadores geneticos do tipo siRNA?

Silenciadores Geneticos Plasmideo shRNA

• o termo shRNa refere-se a RNA que tem a forma de um pequeno ou curto grampo de cabelo
• Plasmideos que codificam shRNA penetram na celula atraves de transfeccao usando agentes de base lipidica
• plasmideos shRNA sao capazes de inibibir temporaria ou permanentemente a expressao de genes alvo.
• Plasmideos shRNA sao fornecidos como um colecao de 3 a 5 plasmideos com vetor de lentivirus os quais codificam alvos especificos de 19-25 nucleotideos shRNA com 6 pares de base em "loop"
• 20 µ g, ate 20 transfeccoes
• a transcripcao de shRNA e controlada por promotor de transcricao H1
• fornecido na forma de plasmideo DNA pronto para transfeccao.
• Apos a transfeccao, celulas que expressam shRNA de forma permanente podem ser selecionadas com puromicina

• Anticorpos controle compativeis estao disponiveis
• RT-PCR Primers estao disponiveis
• Reagente para transfeccao plasmideo shRNA, sc-108061
• Meio para transfeccao Plasmideo shRNA, sc-108062
• Plasmideo shRNA Controle-A, sc-108060
• Plasmideo shRNA Controle-B, sc-108065
• Plasmideo shRNA Controle-C, sc-108066

Confirma a eficiencia do Silenciador Genetico tipo plasmideo shRNA com o plasmideo controle copGFP: sc-108083

Celulas geradas com expressao permanente de shRNA

Como funcionam os silenciadores geneticos tipo Plasmideo shRNA?

Particulas de Lentivirus shRNA

• o termo shRNa refere-se a RNA que tem a forma de um pequeno ou curto grampo de cabelo
• Particulas de lentivirus deixam na celula alvo um plasmideo shRNa
• Util para reducao de expressao (knock-down) temporaria ou permanente de um gene alvo
• Particulas de Lentivirus sao virus prontos para serem transduzidos com a finalidade de silenciar genes alvo em celulas mamiferas (humanas ou de camundongo)
• 200 µl frozen viral stock containing 10⁶ infectious units of virus (IFU), sufficient for 10-20 transductions
• As particulas de lentivirus geralmente contem tres a cinco construtos de expressao, cada construto codifica um shRNA alvo especifico o qual possui 19-25 nucleotideos com um laco do tipo "loop" de 6 pares de base
• Apos a transducao, as celulas que expressam shRNA permanentemente podem ser selecionadas com puromicina
• As particulas lentivirais para controle copGFP permitem confirmar a eficiencia de transducao das particulas lentivirais na populacao de celula alvo atraves da expressao da GFP dectavel via citometria de fluxo ou por microscopia fluorescente.
• Os beneficios do uso de Particulas de Lentivirus shRNA incluem evitar tecnicas de transfeccao prejudiciais as celulas e a introduzir com abilidade shRNA para qualquer tipo de celula.
• Informacoes sobre biosseguranca - As particulas de lentivirus sao replicantes-incompetentes, sendo criadas para auto-inatividade apos transducao e integracao do construto shRNA no DNA genomico das celulas alvo.

• Anticorpos controle compativeis estao disponiveis
• RT-PCR Primers estao disponiveis
• Particulas de Lentivirus shRNA para controle: sc-108080
• copGFP Particulas de Lentivirus controle: sc-108084
• Di-hidro-clorido de Puromicima: sc-108071

Celulas geradas com expressao permanente de shRNA

Como funcionam os silenciadores geneticos do Particulas de Lentivirus?

Quais sao as vantagens do uso de shRNA em comparacao com siRNA?

A transfeccao de silenciadores geneticos tipo siRNA em celulas cultivadas resulta em uma rapida e eficiente reducao na expressao do gene alvo, apesar dessa reducao ser de curta duracao. Para aumentar a duracao da silenciacao genetica, usam-se plasmideos shRNA ou Particulas de Lentivirus de shRNA seguidos de selecao com puromicina. Portanto, se o alvo e a expressao de proteina de "turnover" lento, Plasmideo shRNA ou as Particulas de Lentivirus shRNA sao a opcao ideal.

Qual e a diferenca entre usar Particulas de Lentivirus shRNA e usar Plasmideos shRNA?

Para usar Plasmideos shRNA com o objetivo de silenciar genes alvo e necessario a transfeccao previa. Enquanto isso, as Particulas de Lentivirus shRNA ja se encontram prontas para infectar todo tipo de celula mamifera, incluindo-se celulas primarias e celulas nao-divisiveis. Ambos Plasmideos shRNA e Particulas de Lentivirus shRNA podem ser usados para o desenvolvimento de celulas de expressao de shRNA permanente apos o tratamento seletivo com puromicina. As particulas de lentivirus sao enviadas em gelo seco enquanto que os plasmideos shRNA sao enviados em gelo azul.

Os produtos de lentivirus shRNA da Santa Cruz apresentam algum risco?

Particulas de lentivirus podem ser utilizadas em laboratorios de nivel 2 de Biosseguranca em unidades de cultura celular (e deverao ser tratadas com o mesmo nivel de cautela utilizado para qualquer outro agente potencialmente infeccioso). As particulas de lentivirus sao replicantes-incompetentes e foram criadas para auto-inativacao apos transducao e integracao dos construtos de shRNA no DNA genomico das celulas alvo.

As sequencias dos produtos de shRNA sao as mesmas daquelas relacionadas com os produtos de siRNA para o mesmo gene? Tais sequencias estao disponiveis?

Sim. As sequencias que codificam os nossos Plasmideos shRNA sao as mesmas usadas nos correspondentes Silenciadores Geneticos tipo siRNA. Essas sequencias estao disponiveis aos clientes. Para isso, entre em contato com um de nossos representantes do Sercico Tecnico.

Os Plasmideos shRNA sao fornecidos como um "pool" de 3-5 plasmideos. Sao os mesmos fornecidos separadamente? Os plasmideos shRNA de um pool de um mesmo produto podem ser vendidos separadamente?

Os produtos tipo Plasmideo shRNA sao fornecidos em um unico recipiente (vial). Oferecemos as fitas de siRNA separadamente sob encomenda. No futuro, poderemos vir a oferecer os plasmideos separadamente.

Qual o tipo o tipo de vetor para o lentivirus que voce usa?

O vetor para o lentivirus usado foi construido para uso proprio e e propriedade privada da Santa Cruz. Por favor, entre em contato conosco e nos indique mais especificamente o que e por que voce necessita dessas informacoes. Acreditamos ser possivel responder suas perguntas sem comprometer nosso sigilo comercial.

Que tipo de promotor e usado pelo vetor para a transcricao do shRNA?

O vetor utiliza o promotor H1

Que tipo de marcador para selecao existe no vetor?

O vetor contem um gene resistente a puromicina que codifica a enzima puromicina N-acetiltransferase para a selecao das celulas transfectadas ou transduzidas com sucesso.

Como e possivel propagar o plasmideo com vetor tipo lentivirus?

Os Plasmideos shRNA e as Particulas de Lentivirus sao vendidas como produtos prontos para transfeccao/transducao. Nao ha necessidade de preparacoes adicionais. Silenciadores Geneticos shRNA sao produtos consumidos com o seu uso para os quais nao existem protocolos de propagacao.

O que e copGFP e como essa pode ser util no uso de plasmideos shRNA e Particulas de Lentivirus?

Com a administracao de plasmideo copGFP ou Particulas de Lentivirus copGFP em uma amostra separada de celulas alvo, e possivel identificar a transfeccao ou a eficiencia da transducao viral na populacao de celula alvo. O plasmideo e as Particulas de Lentivirus tipo copepod levam a expressao de Proteina Verde Fluorescente de copepoda, a qual pode ser detectada com o uso de microscopios fluorescentes ou citometria de fluxo.

Qual e a diferenca entre os produtos shRNA (h) e (h2) (por example E-Caderina, sc-35242-SH e sc-44222-SH)?

Os produtos (h) e (h2) sao designados para silenciar o mesmo gene, entretanto possuem sequencia diferentes.

Quais os produtos auxiliares e reagentes de transfeccao devem ser adquiridos da SCBT para uso dos Pasmideos shRNA?

Recomendamos o nosso Reagente de Transfeccao para DNA Plasmideo shRNA , sc-108061 e, ainda, nosso Meio de Transfeccao para DNA Plasmideo shRNA, sc-108062. Recomendamos tambem nossos DNAs plasmideo shRNA controle, sc-108060 (A), sc-108065 (B), ou sc-108066 (C). Esses controle codificam sequencias distorcidas de shRNA que nao afetaram nenhum RNA mensageiro conhecido em celulas mamiferas.

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Referencias

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9. Zhanga, Y., Yanga, H., Xiaoa, B., Wub, M., Zhoua, W., Lia, J., Lib, G. and Christados, P. 2008. Dendritic cells transduced with lentiviral-mediated RelB-specific ShRNAs inhibit the development of experimental autoimmune myasthenia gravis. Mol Imunol, epub.