L'histoire de l'ARN interférence

L'interférence ARN (RNAi) a d'abord été identifiée dans des C. elegans par les lauréats du prix Nobel Fire and Mello (1), et est actuellement l'une des découvertes les plus prometteuses en biologie moléculaire. L'activité endogène des RNAi a été liée à la régulation de la mobilité des transposons(2), la détermination des profils d'expression des gènes (3) et du devenir cellulaire (4). C'est une composante essentielle de la défense cellulaire innée contre l'infection virale in vivo(5). Trois mécanismes RNAi uniques contrôlant l'expression des gènes cibles ont été démontrés. Le RNAi régule la transcription des gènes en modifiant la formation d'hétérochromatine (6). Le RNAi exèrce deux formes de contrôle post-transcriptionnels. Premièrement, l'RNAi peut inhiber la traduction de l'ARNm cible (7) et deuxièment, l'RNAi peut diriger la destruction de l'ARNm cible par le complexe RISC (8). La protéine DICER produit les dsRNA, laissant deux nucléotides de plus au niveau du brin 3'. Ces amorces de dsRNA sont alors transférées au complexe RISC et conduit à l'activation de l'activité enzymatique de l'Argonaute, le composant RNase du complexe RISC qui détruit l'un des brins d'ARN. Le brin guide restant conduit alors le complexe RISC, par liaison complémentaire, à s'associer avec les molécules d'ARN cible et à les cliver.

La découverte des RNAi a introduit un outil de laboratoire extraordinairement puissant pour les chercheurs et est devenu un outil thérapeutique potentiel prometteur. C'est ainsi que Andrew Z. Fire et Craig C. Mello reçurent le prix Nobel 2006 de physiologie et de médecine. En laboratoire, les molécules d'RNAi sont utilisées pour réguler négativement l'expression de gènes cibles spécifiques dans une variété d'organismes et de différents types cellulaires, en exploitant chacun des trois mécanismes de l'inhibition de l'expression des gènes décrits ci-dessus. Ces techniques sont utiles pour la manipulation d'un système expérimental pour explorer des gènes spécifiques et les fonctions des protéines ainsi que leurs relations à d'autres gènes et des protéines. L'RNAi possède également un potentiel clinique passionnant (9).

Les détails de ces mécanismes RNAi sont des sujets populaires d'études rigoureuses, même si beaucoup restent encore à clarifier. Le contrôle RNAi de la dégradation de l'ARNm cible par le complexe RISC, cependant, est le mieux décrit ainsi que le mécanisme destiné aux RNAi Gene Silencers.

Santa Cruz Biotechnology, Inc. vous propose une grande sélection de sa gamme pour l'ARN interférent. siRNAs, Plasmides shRNA et Particules Lentivirales shRNA sont disponibles pour >99% des 23775 gènes humains et 25654 gènes murins putatifs codant des protéines.

Le clivage du mARN par l`ARNi

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siRNA Gene Silencers shARN Plasmides shARN Particules Lentivirales Foire aux questions Haut de la page

siRNA Gene Silencers

• siRNA signifie 'small' ou 'short interfering' RNA - petits ARN interférents
• Transfection des cellules par un agent de transfection ARN à base de lipides
• Utilisable pour l'inhibition du gène cible transitoire

• Les siRNA Gene Silencers sont composés d'un mélange de trois séquences courtes de RNA double brin différentes. Chaque séquence double brin comprend 19-25 nucléotides (nt) avec un excédent 2-nt à l'extrémité 3'.
• 10 µM, 50-100 transfections
• Sur demande le siRNA double brin isolé sont également disponibles, chaque échantillion comporte 3nmol de siRNA lyophilisé afin de verifier mieux les résultats des siRNA pour cibler l´expression de gènes.

• Anticorps de contrôles disponibles
• RT-PCR Primers disponibles
• siRNA Tampon de dilution, sc-29527
• siRNA Agent de transfection, sc-29528
• siRNA Millieu de transfection, sc-36868
• siRNA Coffret de réactifs, sc-45064
• siRNA Contrôles négatifs, comme siRNA-A, sc-37007
• siRNA Contrôles de la transfection, comme siRNA-A (marqués FITC), sc-36869

Comment fonctionnent les siRNA Gene Silencers?

shARN Plasmide Ciblant des Gènes

• shARN signifie 'small hairpin' ou 'short hairpin' ARN
• Transfection des cellules par un agent de transfection ADN à base de lipides
• shARN Plasmides sont capables d'une inhibition du gène cible transitoire ou stable
• shARN Plasmides sont composés d' un mélange de 3 à 5 plasmides de vecteurs lentiviraux d'expression individuels. Chaque vecteur code pour une séquence spécifique de shARN d'une longueur de 19-25 nucléotides (nt) plus une épingle à cheveux (hairpin loop) de 6 paires de bases (bp).
• 20 µg, jusqu'à 20 transfections
• Le transcription de shARN est contrôlé par le promoteur H1
• l'ADN plasmidique est purifié et prêt à l'usage
• Après la transfection, les cellules avec l'expression stable de shARN, peuvent être selectionées par traitement de puromycine

• Anticorps de contrôles disponibles
• RT-PCR Primers disponibles
• shARN Plasmide Agent de transfection, sc-108061
• shARN Plasmide Millieu de transfection, sc-108062
• shARN Plasmide-A Contrôle négatif, sc-108060
• shARN Plasmide-B Contrôle négatif, sc-108065
• shARN Plasmide-C Contrôle négatif, sc-108066

Verifiez l'efficacité de la transfection des shARN Plasmides pour vos cellules avec le copGFP Plasmide Contrôle: sc-108083

Génération des cellules avec l'expr. stable de shARN

Les shARN Plasmides, comment fonctionnent-ils?

shARN Particules Lentivirales

• shARN signifie 'small hairpin' ou 'short hairpin' ARN
• Des Particules Lentivirales apportent des plasmides codant la shARN aux cellules cibles
• Utislisable d'une inhibition du gène cible transitoire ou stable
• Les Particules Lentivirales sont prêtes à l'usage pour la transduction virale des cellules cibles mammifères (humain, murin ou rat)
• 200 µl de particules virales congelées contient 10⁶ unités virales infectieuses (IFU), suffisant pour 10-20 transductions
• shARN Particules Lentivirales sont composées d' un mélange de 3 à 5 vecteurs d'expression individuels. Chaque vecteur code pour une séquence spécifique de shARN d'une longueur de 19-25 nucléotides (nt) plus une épingle à cheveux (hairpin loop) de 6 paires de bases (bp).
• Après la transduction, les cellules avec l'expression stable de shARN, peuvent être selectionées par traitement de puromycine
• Verifiez l'efficacité de la transduction lentiviraux pour vos cellules avec le copGFP Particules Lentivirales Contrôle: sc-108084 en détection de copGFP par cytométrie en flux ou la microscopie en fluorescence.
• Les aventages de l'utilisation de shARN Particules Lentivirales sont l'évitement des agents de transfection et l'aptitude d'introduire du shARN dans chaque type de cellule
• Informations sur la biosécurité - Les Particules Lentivirales sont incompétents à la réplication et sont conçues pour s'auto-inactiver après transduction et intégration des shRNA dans l'ADN génomique de cellules cibles.

• Anticorps de contrôles disponibles
• RT-PCR Primers disponibles
• shARN Particules Lentivirales Contrôle negatif: sc-108080
• copGFP Particules Lentivirales Contrôle: sc-108084
• Puromycine dihydrochloride: sc-108071

Génération des cellules avec l'expr. stable de shARN

Les Particules Lentivirales, comment fonctionnent-elles?

Quel est l'avantage des shARN comparé aux siRNA?

La transfection de siRNA Gene Silencers dans des cellules en culture fournit une diminution rapide et efficace, même si à court terme, de l'expression des gènes cibles. On peut obtenir une inhibition stable en utilisant des plasmides shRNA ou des Particules Lentivirales shARN suivi par une sélection à la puromycine. Ainsi, pour "éteindre" l'expression d'une protéine à faible expression, les plasmides shRNA ou les Particules Lentivirales shRNA seront le choix idéal.

Quelle est la différence entre shARN Particules Lentivirales et shARN Plasmides?

La transfection est nécessaire pour utiliser les plasmides shRNA pour le gene silencing. Alors que les Particules Lentivirales shRNA sont fournies prêtes à ajouter à pratiquement n'importe quel type de cellules de mammifères, y compris les cellules primaires et non divisées. Les Plasmides shRNA et les Particules Lentivirales shRNA peuvent tous deux être utilisés pour développer une expression stable du shRNA avec le traitement à la puromycine. Les Particules Lentivirales sont expédiées carboglace tandis les plasmides shRNA sont expédiés réfrigérés en pain de glace (blue ice).

Est-ce qu'il y a des questions concernant les shARN Particules Lentivirales et la sécurité?

Les Particules Lentivirales peuvent être utilisées dans les laboratoire de biosécurité niveau 2 de culture de tissus (et doivent être traitées avec la même prudence que tout autre réactif potentiellement infectieux). Les Particules Lentivirales sont incompétentes à la réplication et sont conçues pour s'auto-inactiver après transduction et intégration des shRNA dans l'ADN génomique de cellules cibles.

Les séquences utilisées dans les Plasmides shRNA et les Paricules Lentivirales shRNA sont-elles identiques aux siRNA correspondants, dirigés contre le même gène? Publiez-vous ces séquences?

Oui. Les séquences encodées dans nos Plasmides shRNA sont les mêmes que celles utilisées dans les produits correspondants de siRNA Gene Silencer. Ces séquences sont disponibles pour les clients. Pour cela, nous vous invitons à contacter notre service technique.

Les shARN Plasmide comportent un mélange de trois à cinq plasmides différents. Est-ce qu'ils sont livrés en flacons séparés? Est-ce que les plasmides différents sont vendus isolément?

Les produits plasmidiques shRNA sont fournis dans un seul flacon. Nous pouvons fournir les brins de siRNA séparément sur demande. Il sera possible de commander les plasmides séparément à l'avenir.

Quel type de vecteur lentiviral est-ce que vous utilisez? Quel est le "nom du vecteur"?

Le vecteur lentiviral que nous utilisons est un vecteur exclusif de chez Santa Cruz Biotechnology. Si vous avez besoin d'information complémentaires, veuillez nous contacter en nous précisant le but de cette requête. Nous pourrions être en mesure de répondre à votre question sans avoir à divulguer des informations confidentielles.

Quel type de promoteur est utilisé dans votre vecteur pour effectuer la transcription shARN?

Le vecteur utilise un promoteur H1.

Quel type de marqueur de sélection est utilisé dans votre vecteur?

Le vecteur possède un gène de résistance à la puromycine codant l'enzyme puromycine N-acétyltransférase pour la sélection des cellules ayant été transfectées ou transduites avec succès.

Comment faire la propagation du vecteur de plasmide?

Le Plasmides shRNA et les Particules Lentivirales shRNA sont vendus prêts à la transfection/transduction. Aucune préparation supplémentaire n'est nécessaire. Les shRNA Gene Silencers sont des produits consommables pour lesquels aucun protocole de propagation n'est donc fourni.

Que signifie copGFP et comment l'utiliser avec les shARN plasmides et les Particules Lentivirales?

Administrer le plasmide copGFP ou des particules lentivirales copGFP à un échantillon de cellules cibles, permet d'évaluer l'efficacité de la transfection ou de la transduction virale pour la population de cellules cibles. Le plasmide copGFP et des particules lentivirales copGFP conduisent à l'expression de la protéine fluorescente verte copépodes. Cette protéine peut alors être détectée en utilisant un microscope à fluorescence ou un cytomètre en flux.

Quelle est la différence entre les produits shARN (h) et (h2) (p. ex. E-Cadherin, sc-35242-SH et sc-44222-SH?

Les produits (h) et (h2) sont conçus pour réduire l'expression du même gène, mais ont des séquences qui diffèrent.

Quels produits supplémentaires et quel agent de transfection est-ce qu'il faut utiliser avec les shARN Plamides de Santa Cruz Biotechnology?

Nous recommandons pour l'utilisation de nos Plasmides shRNA: notre réactif de transfection Plasmides shRNA, sc-108061, ainsi que le milieu de transfection Plasmides shRNA, sc-108062. Nous recommandons également de notre contrôle Plasmides shRNA, soit sc-108060 (A), SC-108065 (B) ou sc-108066 (C). Ces séquences de shRNA ne ciblent pas les ARNm connus chez les mammifères.

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Bibliographie

1. Fire, A., Xu, S.Q., Montgomery, M.K., Kostas, S.K., Driver, S.E. and Mello, C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.
2. Das, P.P., Bagijn M.P., Goldstein, L.D., Woolford, J.R., Lehrbach, N.J., Sapetschnig, A., Buhecha, H.R., Gilchrist, M.J., Howe, K.L., Stark, R., Matthews, N., Berezikov, E., Ketting, R.F., Tavaré, S. and Miska E.A. 2008. Piwi and piRNAs Act Upstream of an Endogenous siRNA Pathway to Suppress Tc3 Transposon Mobility in the Caenorhabditis elegans Germline. Mol Cell 31: 79-90.
3. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.
4. Georgantas III, R.W., Hildreth, R., Morisot, S., Alder, J., Liu, C.G., Heimfeld, S., Calin, G.A., Croce, C.M. and Civin, C.I. 2007. CD34+ hematopoietic stem-progenitor cell microRNA expression and function: A circuit diagram of differentiation control. PNAS 104: 2750-2755.
5. Chotkowskia, H.L., Ciotab, A.T., Jiab, Y., Puig-Basagoitic, F., Kramerb, L.D., Shic, P.Y. and Glaser, R.L. 2008. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology 377: 197-206.
6. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.
7. Tamura, Y., Yoshida, M., Ohnishi, Y. and Hohjoh, H. 2008. Variation of gene silencing involving endogenous microRNA in mammalian cells. Mol Biol Rep, epub.
8. Hammond,S.M., Boettcher, S., Caudy, A.A., Kobayashi, R. and Hannon, G.J. 2001. Argonaute2, a Link Between Genetic and Biochemical Analyses of RNAi. Science 293: 1146-1150.
9. Zhanga, Y., Yanga, H., Xiaoa, B., Wub, M., Zhoua, W., Lia, J., Lib, G. and Christados, P. 2008. Dendritic cells transduced with lentiviral-mediated RelB-specific ShRNAs inhibit the development of experimental autoimmune myasthenia gravis. Mol Imunol, epub.