| NOTA: Tm valores para PCR primers ofrecido por Santa Cruz Biotechnology Inc. gama es entre 55-60 C (19-21 nt, GC% ~55%). El conjunto del primer anidado A y B el par tienen un base de longitud similar, GC% y Tm valores. |
| NOTA: Nested PCR utilizes two pairs of PCR primers for a single locus. The first primer pair A set amplifies within the locus. The second primer pair B set (nested primers) then binds within the "A" amplicon to produce a second nested "B" amplicon. |
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Prepare la solution conteniendo -
| a) 1 μl oligo (dT)12-18 (500 μg/ml) |
| b) 1 ng-5 μg total ARN |
| c) 1 μl 10 mM dNTPs |
| d) y añada RNase-free agua a un volumen final de 12 μl |
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Incube a 70° C por 5 minutos para minimizar la estructura secundaria del ARN, rápidamente enfría sobre el hielo y luego agrega -
| a) 4 μl 5x reverse transcriptase buffer |
| b) 2 μl 0.1 M DTT |
| c) 1 μl RNase inhibitor |
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Incubate at 42° C for 2 minutes to anneal primer and template. |
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Añada 1 μl reverse transcriptase (200 unidades) y incube a 42° C por 50 minutos para ampliar el primer y luego terminar la reacción de incubación a 70° C por 15 minutos. |
| NOTA: (Como un paso opcional añada 1 μl RNase H (2 unidad/μl) y incube a 37° C por 20 minutos) |
| 2. Primer reacción de PCR |
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Prepare la solution conteniendo -
| a) |
5 μl 10x PCR buffer (con o sin* MgCl2) |
| b) |
*5 μl 25 mM MgCl2 (Puede ser necesario para variar el MgCl2 concentración, la concentración final recomendido es 2.5 mM.) |
| c) |
1 μl 10 mM dNTP |
| d) |
1 μl primer pair A |
| e) |
1 μl Taq DNA polymerase |
| f) |
2 μl de cDNA y añada agua hasta 50 μl |
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Incube a 94° C por 2 minutos para desnaturalizar el cADN |
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Perform 15-40 cycles of PCR. Annealing and extension conditions are primer and template dependent and must be determined empirically for each template-primer pair. |
| 3. Segundo reacción de PCR |
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Prepare la solution conteniendo -
| a) |
5 μl 10x PCR buffer (con o sin* MgCl2) |
| b) |
*5 μl 25 mM MgCl2 (Puede ser necesario para variar el MgCl2 concentración, la concentración final recomendido es 2.5 mM.) |
| c) |
1 μl 10 mM dNTP |
| d) |
1 μl primer pair B |
| e) |
1 μl Taq DNA polymerase |
| f) |
1-5 μl primero PCR producto y añada agua hasta 50 μl |
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Incube a 94° C por 2 minutos para desnaturalizar el cADN |
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Perform 15-40 PCR cycles. Annealing and extension conditions are primer and template dependent and must be determined empirically for each template-primer pair. |
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Los productos de PCR son visualizados en gels de agarosa teñidos con ethidium bromide. |
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Semi-Quantitative Nested RT-PCR |
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