| A. Cultivo Células de Tejido |
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Grow cultured cells on sterile glass cover slips or slides (Cover Glasses and Micro Slides for Immunohistochemistry) overnight at 37º C. Wash briefly with PBS (Buffers and General Solutions) and fix cells by one of the following procedures:
| 1) |
5 minutos en metanol -10º C, en aire seco (método recomendado), o |
| 2) |
2 minutos en acetona frío, aire seco; o |
| 3) |
10 minutos en 1% formalina en PBS (mantenga mojado). |
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Lave en tres cambios de PBS. |
| Opcional: |
Incubate for 5–10 minutes in 0.1–1% hydrogen peroxide in PBS to quench endogenous peroxidase activity. Wash in PBS twice for 5 minutes each. |
| B. Secciones de Tejido Congelado |
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Congele el tejido en bloque con nitrógeno líquido, con acuerdo con los procedimientos estándar. El bloque puede ser almacenado a -70º C hasta para 2 semanas antes de seccionamiento. |
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Limpia las diapositivas de virdio con 95% ethanol, trata con subbing solución y deja secar con aire. O use ya-tratado diapositivas. |
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Cortar a 4 - a 10-secciones micras de grueso. Adhiéra secciones a las diapositivas en temperatura ambiente. Diapositivas pueden ser almacenadas a -70 º C. Descongele las diapositivas en temperatura ambiente antes de fijación y tinción. |
| NOTA: |
Para obtener una lista de medios para mounting Inmunohistoquímica incluyendo Organo/Limonene y Ultra-Cruz™ Mounting, consulte |
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Fija las diapositivas en acetona fría por 10 minutos y mantenga refrigerado (o seleccione otro tipo de procedimiento de fijación). Lave en tres cambios de PBS (Buffers y Soluciones Generales). |
| Opcional: |
Incubate for 5–10 minutes in 0.1–1% hydrogen peroxide in PBS to quench endogenous peroxidase activity. Wash in PBS twice for 5 minutes each. |
| NOTA: |
Para tejidos que contienen altos niveles de endogenous biotin (que puede resultar en un fondo de mayor tinción), nosotros recomendamos el siguiente protocolo de Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Sections como endogenous biotin es normalmente destruido en el tejido embebido de parafina. |
| C. Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Sections |
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Fija los secciones de tejidos en formalin y inserta en bloques de parafina en acuerdo con los procedimientos estándar. |
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Limpia las diapositivas de virdio con 95% ethanol, trata con subbing solución y deja secar con aire. O use ya-tratado diapositivas. |
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Corta los secciónes de tejidos a 4–6 micrón de grueso, y aplica a las diapositivas. En cada uno deparaffinize en xylenes utilizando tres cambios por 5 minutos. Hidrato los secciones gradualmente a través de alcoholes clasificados: lava cada uno en 100% ethanol dos veces por 10 minutos, y luego lave cada uno en 95% ethanol dos veces por 10 minutos. Lave en agua desionizada para un (1) minuto con agitación. Aspire el líquido exceso de las diapositivas |
| Opcional: |
Desenmascaramiento del antígeno se puede realizar en este punto. Algunos determinantes antigénicos están enmascarados por fijación de formalin y parafina fijado y puede ser descubierto por uno de los varios métodos:
| 1) |
Tratamiento de calentar (método recomendado): Ponga las diapositivas en un recipiente y cubre con 10 mM sodium citrate buffer, pH 6,0; o con 50 mM glycine-HCI buffer (glycine: sc-29096), pH 3,5, con 0,01% (w/v EDTA (EDTA: sc-29092). Calienta a 95º C por 5 minutos. Completa con buffer fresca y calienta a 95º C por 5 minutos (el tiempo de incubación óptimo puede variar para cada tipo de tejido). Deje que las diapositivas se enfríe en el buffer para aproximadamente 20 minutos. Lave cada uno en agua desionizada tres veces por 2 minutos. Aspire el líquido exceso de las diapositivas. |
| 2) |
Pepsin: Incube secciones por 10–20 minutos en 0,1% pepsin en 0,01 N HCI en temperatura ambiente. Lave las diapositivas varia veces en agua desionizada. Aspire el líquido exceso de las diapositivas. |
| 3) |
Saponin: Incube secciones por 30 minutos en 0,05% saponin en agua desionizada en temperatura ambiente. Lave por lo menos tres veces en PBS. Aspire el líquido exceso de las diapositivas. |
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| Opcional: |
Incubate for 5–10 minutes in 0.1–1% hydrogen peroxide in deionized H2O to quench endogenous peroxidase activity. Wash in PBS twice for 5 minutes each. |
| D. Tinción con Inmunoperoxidasa |
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Para la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido, nosotros recomendamos el uso de cualquier de los dos Santa Cruz Biotechnology, Inc. productos ABC Staining Systems o el ImmunoCruz™ Staining Systems. El ABC Staining Systems utiliza avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex como un reativo de detección, mientras que el ImmunoCruz™ Staining Systems utiliza streptavidin-horseradish peroxidase complex. El ImmunoCruz™ Staining Systems incluyé todos los reactivos secundarias en un formato pre-diluido, listo para usar. Los protocolos completos de investigación se incluyen con todo los Staining Systems; breve protocolos se indican a continuación. |
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Todo los pasos son hechos en temperatura ambiente en una cámara humidificado. Permite que todo los reactivos de Staining System alcancen temperatura ambiente antes de usar. Los secciónes de tejidos no se deben permitir que se sequen en cualquier momento durante el tiempo del procedimiento. Usa aspiración para quitar los reactivos después de cada paso, pero evita la desecación de las espécimenes entre los pasos. Utilicé suficientes reactivos par cubrir las espécimenes (aproximadamente 100 µl por diapositiva es normalmente suficiente). |
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Incube los espécimenes por una hora en 1,5% de normal blocking serum en PBS (Buffers y Soluciones Generales). Blocking serum (Sera Normal para Inmunohistoquímica) lo ideal sería que se deriva de la misma especie en la que se producio el anticuerpo secundario. Quita el normal blocking serum de las diapositivas. |
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Incube con el anticuerpo primario por 30 minutos en temperatura ambiente o durante la noche a 4º C. La concentración óptima del anticuerpo debe ser determinado por titration; la gama recomendado es de 0,5–5,0 µg/ml diluido en PBS con 1,5% de normal blocking serum. Lave cada uno con tres cambios de PBS por 5 minutos. |
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Incube por 30 minutos con biotin-conjugado anticuerpo secundario tan como esta proporcionado o a aproximadamente 1 µg/ml diluida en PBS con 1.5% normal blocking serum. Lave cada uno con tres cambios de PBS por 5 minutos. |
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Incube por 30 minutos con el reactivo de avidin biotin enzima. Lave cada uno con tres cambios de PBS por 5 minutos. |
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Incube en peroxidase substrate como dado por 30 segundos–10 minutos o hasta que la intesidad de la tinta deseada esta desarrollado. Las diapositivas individuales deben ser vigiló para determinar el tiempo de desarrollo apropiado. Lave los secciónes en agua desionizada por 5 minutos. Si deseado, contra tinta en Gill´s formulation #2 hematoxylin (sc-24973) por 5–10 segundos. Lave inmediatamente con varios cambios de agua desionizada. |
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Deshidratar a través de los alcoholes y xylenes de la siguiente manera: Remoje cada uno en 95% ethanol dos veces por 10 segundos y luego xylenes tres veces cada uno por 10 segundos. Limpie el exceso de xylene. Inmediatamente añada 1–2 gotas de permanente medio de mounting (por ejemplo, Clarion sc-24942), cubre con un cubreobjectos de vidrio (sc-24975) y observa por microscopio óptico. |
| ImmunoCruz™ Sistemas de Tinción |
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Incube los espécimenes por 20 minutos en 1–3 gotas de serum block. Aspirar el suero de las diapositivas. |
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Diluye el anticuerpo primario en el bloque de suero a 0.5–5.0 µg/ml como se determina por titration. Incube por 2 horas. Enjuague con PBS (Buffers and General Solutions) y luego lave cada uno con PBS dos veces por 2 minutos en una agitar placa. Aspire el exceso de líquido de las diapositivas. |
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Incube por 30 minutos en 1–3 gotas de biotinylated anticuerpo secundario. Lave como se menciona anteriormente. |
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Incube por 30 minutos en 1–3 gotas de HRP-streptavidin complex. Lave como se menciona anteriormente. |
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Añada 1–3 gotas de HRP substrate mezcla. Desarrolla por 30 seguntos–10 minutos, o hasta que la intesidad de la tinta esta desarrollado. Enjague con agua desionizada y transferencia a una agitar placa y lave con agua desionizada por 2 minutos. |
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Contra tinta, deshidrata y monta las diapositivas como se describe en el ABC Staining Systems. |
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Immunoperoxidase Staining |
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