| A. Cultivo Células de Tejido |
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Grow cultured cells on sterile glass cover slips or slides (Cover Glasses and Micro Slides for Immunohistochemistry) overnight at 37º C. Wash briefly with PBS (Buffers and General Solutions) and fix cells by one of the following procedures:
| 1) |
5 minutos en metanol -10º C, en aire seco (método recomendado), o |
| 2) |
2 minutos en acetona frío, aire seco; o |
| 3) |
10 minutos en 1% formalina en PBS (mantenga mojado). |
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Lave en tres cambios de PBS. |
| B. Secciones de Tejido Congelado |
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Congele el tejido en bloque con nitrógeno líquido, con acuerdo con los procedimientos estándar. El bloque puede ser almacenado a -70º C hasta para 2 semanas antes de seccionamiento. |
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Limpia las diapositivas de virdio con 95% ethanol, trata con subbing solución y deja secar con aire. O use ya-tratado diapositivas. |
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Cortar a 4 - a 10-secciones micras de grueso. Adhiéra secciones a las diapositivas en temperatura ambiente. Diapositivas pueden ser almacenadas a -70 º C. Descongele las diapositivas en temperatura ambiente antes de fijación y tinción. |
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Fija las diapositivas en acetona fría por 10 minutos y mantenga refrigerado (o seleccione otro tipo de procedimiento de fijación). Lave en tres cambios de PBS (Buffers y Soluciones Generales). |
| NOTA: |
Para tejidos que contienen altos niveles de endogenous biotin (que puede resultar en un fondo de mayor tinción), nosotros recomendamos el siguiente protocolo de Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Sections como endogenous biotin es normalmente destruido en el tejido embebido de parafina. |
| C. Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Sections |
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Fija los secciones de tejidos en formalin y inserta en bloques de parafina en acuerdo con los procedimientos estándar. |
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Limpia las diapositivas de virdio con 95% ethanol, trata con subbing solución y deja secar con aire. O use ya-tratado diapositivas. |
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Corta los secciónes de tejidos a 4–6 micrón de grueso, y aplica a las diapositivas. En cada uno deparaffinize en xylenes utilizando tres cambios por 5 minutos. Hidrato los secciones gradualmente a través de alcoholes clasificados: lava cada uno en 100% ethanol dos veces por 10 minutos, y luego lave cada uno en 95% ethanol dos veces por 10 minutos. Lave en agua desionizada para un (1) minuto con agitación. Aspire el líquido exceso de las diapositivas |
| Opcional: |
Desenmascaramiento del antígeno se puede realizar en este punto. Algunos determinantes antigénicos están enmascarados por fijación de formalin y parafina fijado y puede ser descubierto por uno de los varios métodos:
| 1) |
Tratamiento de calentar (método recomendado): Ponga las diapositivas en un recipiente y cubre con 10 mM sodium citrate buffer, pH 6,0; o con 50 mM glycine-HCI buffer (glycine: sc-29096), pH 3,5, con 0,01% (w/v EDTA (EDTA: sc-29092). Calienta a 95º C por 5 minutos. Completa con buffer fresca y calienta a 95º C por 5 minutos (el tiempo de incubación óptimo puede variar para cada tipo de tejido). Deje que las diapositivas se enfríe en el buffer para aproximadamente 20 minutos. Lave cada uno en agua desionizada tres veces por 2 minutos. Aspire el líquido exceso de las diapositivas. |
| 2) |
Pepsin: Incube secciones por 10–20 minutos en 0,1% pepsin en 0,01 N HCI en temperatura ambiente. Lave las diapositivas varia veces en agua desionizada. Aspire el líquido exceso de las diapositivas. |
| 3) |
Saponin: Incube secciones por 30 minutos en 0,05% saponin en agua desionizada en temperatura ambiente. Lave por lo menos tres veces en PBS. Aspire el líquido exceso de las diapositivas. |
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| D. Tinto de inmunofluorescente |
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Utilize aspiración para quitar los reactivos después de cada paso, pero evitar la desecación de las espécimenes entre los pasos. Utilize suficiente reactivo para cubrir el espécimen (aproximadamente 100–500 µl por diapositiva es suficiente). |
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Incube los espécimenes con 10% normal blocking serum (Sera Normal para Inmunohistoquímica) en PBS (Buffers y Soluciones Generales) por 20 minutos para suprimir el no-específico unión de IgG. El bloqueo de suero idealmente sería derivado de la misma especie en la que se producio el anticuerpo secundario. Lave con PBS. |
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Incube con el anticuerpo primario por 60 minutos. La concentración óptimal de anticuerpo tiene que ser determinado por titration; la gama recomendido es de 0,5–5,0 µg/ml en PBS con 1,5% normal blocking serum. Lave cada uno con tres cambios de PBS por 5 minutos. |
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Incube por 45 minutos con cualquiera de los dos, biotin-conjugated o fluorochrome-conjugated anticuerpo secundario (Anticuerpos Secundarios para Inmunohistoquímica) diluye a 1–5 µg/ml en PBS con 1,5%–3% bloqueo normal de suero. La concentración óptima del anticuerpo debe de ser determinado por titration. Lave con tres cambios de PBS. Si el fluorochrome-conjugated anticuerpo secundario esta utilizado, incube en una cámara oscura y omita el siguiente paso. |
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Incube con streptavidin-fluorescein por 15 minutos en una cámara oscura. Para óptimal concentración de streptavidin conjugado para cualquier aplicación dada, debe ser determinado por titration; la gama recomendido es de 10–20 µg/ml en PBS. Lave extensivamente con PBS. |
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Monta el cubreobjetos con un medio de acuosa mounting o 90% glycerol en PBS. |
| NOTA: |
Para obtener una lista de medios para mounting Inmunohistoquímica incluyendo Organo/Limonene y Ultra-Cruz™ Mounting, consulte |
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Examine utilizando un microscopio de fluorescencia con filtros adecuados. Conserva las diapositivas en un lugar oscuro en temperatura ambiente (UltraCruz™ Mounting Medium: sc-24941) o a 4º C (glycerol/PBS mount). |
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Immunofluorescence Cell Staining |
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