Historia del ARNi

El ARN de interferencia (ARNi) fue identificado por primera vez en C. elegans por Fire y Mello, receptores del Premio Nobel (1), y ahora representa uno de los descubrimientos mas prometedores de la biologia molecular. La actividad del ARNi endogeno ha sido relacionada con la regulacion de la movilidad de los transposones (2), la determinacion de perfiles de expresion genetica (3), y el destino celular (3), a la vez que es un componente crucial de la defensa celular innata contra infecciones virales in vivo (5). Se han demostrado tres mecanismos de ARNi caracteristicos que controlan la expresion de un gen de interes dado. El ARNi regula la transcripcion genetica mediante la modificacion de la formacion de heterocromatina (6). El ARNi ejercita dos formas de control luego de la transcripcion. En primer lugar, el ARNi puede inhibir la traduccion de un ARNm dado (7), y en segundo lugar, el ARNi puede dirigir la destruccion de un ARNm dad a traves del complejo RISC (8). Las Dicer primero procesan el ARNdc dejando un resto 3' de dos nucleotidos. Esto prepara al ARNdc para su union al complejo RISC, y conlleva a la activacion de la actividad enzimatica de la proteina argonauta, el componente de ARNsc del complejo RISC que destuye una de las cadenas del ARN. La cadena guia restante, a traves de una union complementaria, hace entonces que el complejo RISC se asocie con las moleculas de ARN de interes.

El descubrimiento del ARNi introdujo una herramienta de poder extraordinario para investigadores y se transformo en una herramienta de prometedor potencial terapeutico, conllevando al Premio Nobel de 2006 en Fisiologia o Medicina para Andrew Z. Fire y Craig C. Mello. En el laboratorio, las moleculas de ARNi se usan para reducir la actividad de la expresion genetica de interes en una variedad de organismos y tipos celulares, explotando cada uno de los tres mecanismos de inhibicion de expresion celular mencionados antes. Estas tecnicas son utiles para manipular un sistema experimental para explorar funciones individuales de genes y proteinas, asi como sus relaciones con otros genes y proteinas. El ARNii tambien tiene un interesante potencial clinico (9).

Los detalles de estos mecanismos de ARN interferente son frecuentemente estudiados con rigurosidad, aunque todavia queda mucho por elucidar. El control de ARNi de la degradacion del ARNm a traves del complejo RISC, sin embargo, ha sido identificado y descripto, asi como el mecanismo de los silenciadores de genes ARNi.

Santa Cruz Biotechnology, Inc. ofrece una linea completa de Silenciadores de Genes de ARNi, incluyendo RNAic, plasmidos ARNhc y productos lentivirales de ARNhc cubriendo mas del 99% de los genes codificadores de proteinas en humanos y ratones.

Clivaje de ARNm dirigido por ARNi

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Silenciadores de Genes siRNA shRNA Plasmids shRNA Lentiviral Particles Preguntas Frequentes Volver arriba

Silenciadores de Genes siRNA

• ARNic se refiere al ARN de interferencia corto
• Requiere la transfeccion de celulas usando un agente de transfeccion lipidico
• Util para un silenciado temporario

• Los Silenciadores de Genes de ARNic son conjuntos de 3 moleculas de ARN de doble cadena especificas de entre 19 y 25 nucleotidos de largo, con 2 sobrantes en 3' por cada extremo.
• 10 µM, 50-100 transfecciones
• para una verificacion independiente de los resultados del silenciamiento de genes, tambien se provee bajo pedido los componented individuales de ARNic

• Se dispone de convenientes anticuerpos de control
• Se dispone de iniciadores de PCR de tiempo real
• Bafer de Dilucion de ARNic, sc-29527
• Agente de Transfeccion de ARNic, sc-29528
• Sustrato de Transfeccion de ARNic, sc-36868
• Sistema de Agentes de ARNic, sc-45064
• ARNic de control, incluyendo ARNic-A, sc-37007
• ARNic de Control (Conjugado a FITC)-A, sc-36869

Como funcionan los Silenciadores de Genes de ARNic?

Silenciadores de Genes de Plasmidos de ARNhc

• ARNhc se refiere al ARN horquillado corto
• Los Plasmidos que codifican el ARNhc entran en la celula a traves de la transfeccion lipidica
• Los Plasmidos de ARNhc son capaces de una temporaria o estable inhibicion de la expresion de los genes de interes
• Los Plasmidos de ARNhc se proveen a manera de un conjunto de cinco vectores plasmidos lentivirales, cada uno de los cuales codifica para un ARNhc especifico de 19 a 25 nucleotidos de largo con un una curva de 6 pares de bases
• 20 µg, hasta 20 transfecciones
• La transcripcion de ARNhc se encuentra bajo el control del promotor H1
• Se ofrece en la forma de ADN plasmido purificado y listo para la transfeccion
• Luego de la transfeccion, se puede seleccionar las celulas que expresan el ARNhc de manera estable a traves del tratamiento con puromiocina

• Se dispone de convenientes anticuerpos de control
• Se dispone de iniciadores de PCR de tiempo real
• Agente de Transfeccion de Plasmidos de ARNhc, sc-108061
• Substrato de Transfeccion de Plasmido de ARNhc, sc-108062
• Plasmido de ARNhc-A de Control, sc-108060
• Plasmido de ARNhc-B de Control, sc-108065
• Plasmido de ARNhc-C de Control, sc-108066

Confirme la eficiencia del Silenciador de Genes de Plasmidos de ARNhc con el Plasmido de Control copGFP: sc-108083

Genere Celulas con expresion estable de ARNhc

Como funcionan los Silenciadores de Genes de Plasmidos de ARNhc?

shRNA Lentiviral Particles

• ARNhc se refiere al ARN horquillado corto
• Las Particulas Lentivirales proveen un plasmido codificante de ARNhc a la celula de interes
• Utiles parala silenciacion temporaria o estable de un gen de interes
• Las Particulas Lentivirales se proveen a manera de viruses listos para la transduccion para la silenciacion dirigida de genes de celulas mamiferas (humanas o de raton)
• 200 µl frozen viral stock containing 10⁶ infectious units of virus (IFU), sufficient for 10-20 transductions
• Las Particulas Lentivirales generalmente contienen de 3 a 5 componentes de expression, cada uno de los cuales codifica un objetivo especifico de 19-25 nucleotidos con una curva de 6 pares de bases
• Luego de la transduccion, se puede seleccionar las celulas que expresan el ARNhc de manera estable a traves del tratamiento con puromiocina
• Las Particulas Lentivirales de Control de copGFP permiten la confirmacion de la eficiencia de transduccion de las Particulas Lentivirales en una poblacion celular de interes mediante la exprecion de GFP, detectable mediante citometria de flujo o microscopia fluorecente.
• Los beneficios de usar Particulas Lentivirales de ARNhc incluyen el evitar tecnicas problematicas de transfeccion y la habilidad de introducir ARNhc a cualquier tipo celular.
• Informacion de Bioseguridad - Las Particulas Lentivirales son incapaces de replicarse y se diseñan para auto-inactivarse luego de la transduccion e integracion de los componentes de ARNhc dentro del ADN genomico de la celula de interes.

• Se dispone de convenientes anticuerpos de control
• Se dispone de iniciadores de PCR de tiempo real
• Particulas Lentivirales de control ARNhc: sc-108080
• Particulas Lentivirales de Control copGFP: sc-108084
• Puromiocina dihidroclorida: sc-108071

Genere Celulas con expresion estable de ARNhc

Como funcionan los Silenciadors de Genes con Particulas Lentivirales?

Cuales son las ventajas de usar ARNhc en vez de ARNic?

La transfeccion de los Silenciadores de Genes de ARNic dentro de celulas cultivadas provee una eficiente y rapida reduccion de la expesion del gen de interes, aunque de poca duracion. Se puede alcanzar la silenciacion estable usando plasmidos de ARNhc o Particulas Lentivirales de ARNhc, seguido por la seleccion con puromiocina. De modo que, cuando se intenta modificar la expresion de una proteina con renovacion lenta, los plasmidos de ARNhc o las Particulas Lentivirales de ARNhc serian ideales para tal objetivo.

Cual es la diferencia entre el uso de Particulas Lentivirales de con ARNhc en vez de Plasmidos de ARNhc?

Para usar Plasmidos de ARNhc en la silenciacion genetica se requiere de la transfeccion, mientras que las Particulas Lentivirales de ARNhc se encuentran listas para agregarse a practicamente cualquier tipo celular mamifero, incluyendo celulas primarias y celulas que no se dividen. Ambos tipos de ARNhc se pueden usar para desarrollar una expresion estable del ARNhc con el tratamiento de puromiocina. Las particulas lentivirales se envian en hielo seco, mientras que los Plasmidos de ARNhc se envian en hielo azul.

Existe algun riesgo para la seguridad en cuanto al uso de los productos lentivirales de ARNhc?

Las particulas lentivirales se pueden usar en los niveles de bioseguridad mas comunes: Establecimientos de cultivo celular de nivel II de bioseguridad (y se las deberia tratar con el mismo nivel de precaucion que con muchos otros agentes potencialmente infecciosos. Las Particulas Lentivirales son incapaces de replicarse y se diseñan para auto-inactivarse luego de la transduccion e integracion de los componentes de ARNhc dentro del genoma de ADN de las celulas de interes.

Se trata de las mismas secuencias para los productos de ARNhc y ARNic dirigidos a un mismo gen? Esas secuencias, se encuentran disponibles?

Si. Las secuencias de nuestros Plasmidos de ARNhc son las mismas que las de los silenciadores de genes de ARNic dirigidas al mismo gen. Dichas secuencias se encuentran disponibles para nuestros clientes. Pongase en contacto con su representante tecnico.

Los Plasmidos de ARNhc se proveen a manera de un conjunto de 3 a 5 plasmidos. Se proveen en envases separados? Se venden por separado los plasmidos individuales de ARNhc?

Los plasmidos de ARNhc se envian en un envase. Ofrecemos las cadenas de ARNic por separado bajo pedido. Quizas ofrescamos los plasmidos por separado en el futuro.

Que clase de vectores lentivirales usan? Cual es el "nombre del vector"?

El vector lentiviral que usamos ha sido hecho especialmente, y se encuentra patentado. Por favor avisenos que informacion necesita y por que. Quizas podamos responder a sus preguntas sin divulgar informacion patentada.

Que clase de promotos usa su vector para la transcripcion de ARNhc?

El vector usa un promotos H1

Que clase de marcador(es) de seleccion hay en el vector?

El vector tiene un gen de resistencia a la Puromiocina que codifica para la enzyma puromiocina N-acetiltransferasa para la selccion de celulas con exitosa transfeccion o transduccion.

Como propagan el plasmido del vector lentiviral?

Las Particulas Lentivirales y los Plasmidos de ARNhc se venden como productos listos para la transfeccion/ transduccion. No es necesaria ninguna preparacion adicional. Los Silenciadores de Genes de ARNhc son productos de consumo para los cuales no se proveen los protocolos de propagacion.

Que es el copGFP y de que manera ayuda al uso de Plasmidos ARNhc y Particulas Lentivirales?

Mediante la administracion de plasmidos o particulas lentivirales con copGFP a un conjunto separado de las celulas de interes, se puede identificar la transfeccion o la eficiencia de la transduccion viral para la poblacion celular de interes. Los plasmidos o particulas lentivirales con copGFP conllevan a la expresion de la proteina fluorescente verde copepod, la cual se puede detectar usando un microscopio de fluorescencia o citometria de flujo.

Cual es la diferencia entre los productos de ARNhc (h) y (h2)- (por ejemplo E-Cadherin, sc-35242-SH and sc-44222-SH)?

Los productos (h) y (h2) estan diseñados para silenciar el mismo gen, pero tienen secuencias distintas.

Que productos de apoyo y agentes de transfeccion debo comprar de SCBT para usar sus plasmidos de ARNhc?

Recomendamos nuestro Agente de Transfeccion de ADN plasmido de ARNhc, sc-108061, ademas del substrato de Transfeccion de DNA plasmido de ARNhc, sc-108062. Tambien recomendamos nuestro Plasmido de ARNhc de ADN, cualquiera de los siguientes: 108060 (A), sc-108065 (B) o sc-108066 (C). Estos codifican secuencias de ARN que no seran dirigidas a ningun ARNm mamifero conocido.

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Conferencias

1. Fire, A., Xu, S.Q., Montgomery, M.K., Kostas, S.K., Driver, S.E. and Mello, C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.
2. Das, P.P., Bagijn M.P., Goldstein, L.D., Woolford, J.R., Lehrbach, N.J., Sapetschnig, A., Buhecha, H.R., Gilchrist, M.J., Howe, K.L., Stark, R., Matthews, N., Berezikov, E., Ketting, R.F., Tavaré, S. and Miska E.A. 2008. Piwi and piRNAs Act Upstream of an Endogenous siRNA Pathway to Suppress Tc3 Transposon Mobility in the Caenorhabditis elegans Germline. Mol Cell 31: 79-90.
3. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.
4. Georgantas III, R.W., Hildreth, R., Morisot, S., Alder, J., Liu, C.G., Heimfeld, S., Calin, G.A., Croce, C.M. and Civin, C.I. 2007. CD34+ hematopoietic stem-progenitor cell microRNA expression and function: A circuit diagram of differentiation control. PNAS 104: 2750-2755.
5. Chotkowskia, H.L., Ciotab, A.T., Jiab, Y., Puig-Basagoitic, F., Kramerb, L.D., Shic, P.Y. and Glaser, R.L. 2008. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology 377: 197-206.
6. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.
7. Tamura, Y., Yoshida, M., Ohnishi, Y. and Hohjoh, H. 2008. Variation of gene silencing involving endogenous microRNA in mammalian cells. Mol Biol Rep, epub.
8. Hammond,S.M., Boettcher, S., Caudy, A.A., Kobayashi, R. and Hannon, G.J. 2001. Argonaute2, a Link Between Genetic and Biochemical Analyses of RNAi. Science 293: 1146-1150.
9. Zhanga, Y., Yanga, H., Xiaoa, B., Wub, M., Zhoua, W., Lia, J., Lib, G. and Christados, P. 2008. Dendritic cells transduced with lentiviral-mediated RelB-specific ShRNAs inhibit the development of experimental autoimmune myasthenia gravis. Mol Imunol, epub.