Historia del RNAi

El ARN de interferencia (ARNi) fue descrito por primera vez en C. elegans, por los Premios Novel Fire y Mello (1), y representa en la actualidad uno de los descubrimientos más prometedores de la biología molecular. La actividad del ARNi endógeno ha sido relacionada con la regulación de la movilidad de los transposones (2), la determinación de perfiles de expresión genética (3), y el destino celular (3), además de ser un componente crucial en la defensa celular innata contra infecciones virales in vivo (5). Se han demostrado tres mecanismos de ARNi únicos, que controlan la expresión de un gen de interés. El ARNi regula la transcripción mediante modificaciones en la formación de heterocromatina (6). El ARNi ejerce dos formas de control post- transcripcional. En primer lugar, puede inhibir la traducción de un ARNm dado (7), y en segundo lugar, puede dirigir la destrucción de un ARNm dado a través del complejo RISC (8). Primero las DICER procesan el dsARN dejando un resto de dos nucleótidos en 3'. Esto permite que el dsARN se una al complejo RISC y conduce la activación de la actividad enzimática de la proteína Argonauta, componente ARNasa del complejo RISC, que destruye una de las cadenas del ARN. La hebra guía restante, mediante unión complementaria, lleva al complejo RISC a asociarse/escindir las moléculas de ARN de interés.

El descubrimiento del ARNi introdujo una herramienta de poder extraordinario para la investigaxión y se transformó en una herramienta de prometedor potencial terapéutico, lo que dio el Premio Nobel de 2006 en Fisiología y Medicina a Andrew Z. Fire y Craig C. Mello. En el laboratorio, las moléculas de ARNi se usan para reducir la expresión génica de las dianas de interés en variedad de organismos y tipos celulares, explotando cada uno de los tres mecanismos de inhibición de expresión celular mencionados. Estas técnicas son útiles para manipular un sistema experimental y explorar funciones individuales de genes y proteínas, así como sus relaciones con otros genes y proteínas. El ARNi también tiene un interesante potencial clínico (9).

Los detalles de estos mecanismos de ARN interferente son estudiados con rigurosidad, aunque todavía queda mucho por elucidar. Sin embargo el control del ARNi en la degradación del ARNm a través del complejo RISC, ha sido identificado y descrito, así como el mecanismo de los silenciadores de genes ARNi.

Santa Cruz Biotechnology, Inc. ofrece una línea completa de Silenciadores Génicos de ARNi, incluyendo siARN, plásmidos shARN y productos lentivirales de shARN cubriendo más del 99% de los genes que codifican porteínas de humano y ratón.

ARNi- dirigido a la escisión de mARN

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Silenciadores de Genes siRNA Plásmidos shRNA shRNA partículas antivirales Preguntas Frecuentes Volver arriba

Silenciadores de Genes siRNA

• siARN hace referencia a un pequeño o corto ARN de interferencia
• Es necesario transfectar las células usando un reactivo de transfección de base lipídica
• Es útil para un knock-down transitorio

• Los Silenciadores Génicos siARN son grupos de tres moléculas de ARN de doble cadena cuya diana es específicas para 19-25 nucleótidos, con 2-nt saliendo de cada extremo 3'.
• 10 µM, 50-100 transfecciones
• para una verificación independiente de los resultados del silenciamiento de genes, también se provee bajo pedido los componentes individuales de ARNic

• Hay disponibles adecuados anticuerpos control
• Se encuentran disponibles Primers para RT-PCR
• Tampón de dilución de siRNA , sc-29527
• Reactivo de Transfección de siRNA , sc-29528
• Sustrato de Transfección de siRNA , sc-36868
• Sistema de Reactivos de siRNA, sc-45064
• siRNAs control, incluyendo control siRNA-A, sc-37007
• siARN Control (FITC Conjugado)-A, sc-36869

¿Cómo funcionan los Silenciadores de Genes siRNA ?

Silenciadores Génicos shRNA (Plásmidos)

• shRNA se refiere una corta horquilla de ARN
• Los plásmidos codificados en el shARN entran en la célula mediante transfección de base lipídica
• plásmidos de shARN pueden producir inhibición estable o transitoria del gen diana
• Los Plásmidos de shARN se proporcionan como un conjunto de cinco vectores plásmidicos lentivirales, cada uno de los cuales codifica para un shARN especÍfico de 19-25 nt con un bucle de 6 pb
• 20 µg, hasta 20 transfecciones
• la transcripción de shARN esta en control del promotor H1
• proporcionado como un plásmido purificado de ADN listo para la transfección
• Tras la transfección, las células que expresan shARN de forma estable pueden seleccionarse con Puromicina

• Hay disponibles adecuados anticuerpos control
• Se encuentran disponibles Primers para RT-PCR
• Agente para Transfección de Plásmidos de shARN, sc-108061
• Medio para Plásmidos de Transfección de shARN, sc-108062
• shRNA control Plásmido-A, sc-108060
• shRNA control Plásmido-B, sc-108065
• shRNA control Plásmido-C, sc-108066

Confirme la eficiencia de la transfección del Plásmido Silenciador Génico shARN, con el Plásmido Control copGFP: sc-108083

Generar células con expresión estable de shARN

¿Cómo funcionan los Silenciadores de Genes shARN?

shRNA partículas antivirales

• shRNA se refiere una corta horquilla de ARN
• Las Partículas Lentivirales proporcionan un plásmido de shARN a las células diana
• Útiles ya sea para knock- down estable o transitorio del gen diana
• Las Partículas Lentivirales se proporcionan como virus listos para la transducción y silenciación de genes diana de células mamíferas (humanas o de ratón)
• 200 µl de virus congelado contiene 10⁶ unidades infecciosas del virus (IFU), suficiente para 10-20 transducciones
• Las Partículas Lentivirales generalmente contienen de 3 a 5 constructos de expressión, cada uno de los cuales codifica una diana específica de 19-25 nt shARN con un bucle de 6 pb
• Tras la traducción, las células que expresan de manera estable el shARN pueden ser seleccionadas mediante tratamiento con puromicina.
• Las Partículas Lentivirales de Control copGFP permiten confirmar la eficiencia de transducción de las Partículas Lentivirales en la población de células diana mediante la expresión de GFP, detectable mediante citometría de flujo o microscopía de fluorescencia.
• Los beneficios de usar shARN en Partículas Lentivirales incluyen evitar técnicas problemáticas de transfección y la capacidad de introducir shARN en cualquier tipo celular.
• Información de Bioseguridad- Las Partículas Lentivirales son incapaces de replicarse y se diseñan para auto-inactivarse tras la transducción e integración de los componentes del shARN en el ADN genómico de las células diana.

• Hay disponibles adecuados anticuerpos control
• Se encuentran disponibles Primers para RT-PCR
• shRNA Lentiviral de control: sc-108080
• Partículas Lentivirales de Control copGFP: sc-108084
• Dihidrocloruro de puromicina: sc-108071

Generar células con expresión estable de shARN

¿Cómo funcionan los Silenciadores de Genes de Partículas Lentivirales?

¿Qué ventajas tiene usar shARN en vez de siARN?

La transfeccion de los Silenciadores de Genes de ARNic dentro de celulas cultivadas provee una eficiente y rapida reduccion de la expesion del gen de interes, aunque de poca duracion. Se puede alcanzar la silenciacion estable usando plasmidos de ARNhc o Particulas Lentivirales de ARNhc, seguido por la selección con puromiocina. De modo que, cuando se intenta modificar la expresion de una proteina con renovacion lenta, los plasmidos de ARNhc o las Particulas Lentivirales de ARNhc serian ideales para tal objetivo.

¿Qué diferencias hay entre Partículas Lentivirales de shARN y Plásmidos shARN?

Para el uso de Plásmidos de shARN es necesaria la transfección. Mientras que las Partículas Lentivirales de shARN están listas para usar prácticamente en cualquier tipo celular, incluyendo cultivos primarios y células que no se dividen. Tanto los Plásmidos de shARN como las Partículas Lentivirales pueden utilizarse para expresar de forma estable el shARN tras tratamiento con puromicina. Las Partículas Lentivirales se envían en hielo seco, mientras que los plásmidos se envían en hielo Azul.

¿Poseen los productos Lentivirales de shARN alguna limitación de seguridad?

Las partículas lentivirales se pueden emplear en las instalaciones de cultivo celular con Nivel de Bioseguridad 2 (deben tratarse con el mismo nivel de precaución que cualquier otro agente infeccioso). Las Partículas Lentivirales son incapaces de replicarse y están diseñadas para auto-inactivarse tras la transducción e integración de los componentes del shARN dentro del ADN de las células de interés.

¿Las secuencias de los shARN son las mismas que las de los siARN del mismo gen? ¿Las secuencias se encuentran disponibles?

Si. Las secuencias de nuestros Plásmidos de shARN son las mismas que las de los silenciadores de genes de siARN dirigidas al mismo gen. Dichas secuencias se encuentran disponibles para nuestros clientes. Póngase en contacto con su Representante del Servicio Técnico.

Los Plásmidos de shARN se proporcionan como un conjunto de 3 a 5 plásmidos. ¿Se envían en envases separados?. Los plásmidos individuales de shARN, ¿se venden por separado?

Los plásmidos de shARN son enviados en un solo enviase. Ofrecemos las hebras de siARN por separado previo pedido. Puede que en el futuro ofrezcamos los plásmidos por separado.

¿Qué tipo de vectores lentivirales utilizan? ¿Cuál es el "nombre del vector"?

El vector lentiviral que usamos ha sido fabricado por nosotros, y se encuentra patentado. Por favor indíquenos que información necesita y por qué. Quizás podamos responder a sus preguntas sin revelar información confidencial.

¿Qué tipo de promotor de transcripción utiliza su vector shARN?

El vector usa un promotor H1

¿Que clase de marcador(es) de selección hay en el vector?

El vector contiene un gen de resistencia a la Puromicina que codifica la enzima N-acetiltransferasa para seleccionar las células cuya trasfección ha sido satisfactoria.

¿Cómo se prolifera el plásmido del vector lentiviral?

Las Partículas Lentivirales y los Plásmidos de shARN se venden como productos listos para la transfección/transducción. No es necesaria ninguna preparación adicional. Los Silenciadores Génicos de shARN son productos para el consumo para los cuales no se proveen los protocolos de proliferación.

¿Qué es el copGFP y cómo es útil para su uso con Plásmidos shARN y Partículas Lentivirales?

Mediante la transfección de plásmidos o partículas lentivirales copGFP al conjunto de células de interés, puede saber la eficiencia de la transfección/transducción viral en su población celular. Los plásmidos o partículas lentivirales con copGFP expresan una proteina verde fluorescente copepod, que puede ser detectada usando un microscopio de fluorescencia o citometría de flujo.

¿Cuál es la diferencia entre los productos shARN (h) y (h2)- (por ejemplo E-Cadherin, sc-35242-SH and sc-44222-SH)?

Los productos (h) y (h2) están diseñados para silenciar el mismo gen, pero tienen secuencias distintas.

¿Que productos complementarios y reactivos de transfección debo comprar a SCBT para utilizar sus plásmidos de shARN?

Recomendamos nuestro shARN Reactivo de Transfección de ADN , sc-108061, además del shARN Medio de Transfección de DNA, sc-108062. También recomendamos nuestro Plásmido de shARN Control, cualquiera de los siguientes: 108060 (A), sc-108065 (B) o sc-108066 (C). Estos codifican secuencias de ARN que no son dirigidos contra ningún ARNm de mamífero conocido.

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References

1. Fire, A., Xu, S.Q., Montgomery, M.K., Kostas, S.K., Driver, S.E. and Mello, C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.
2. Das, P.P., Bagijn M.P., Goldstein, L.D., Woolford, J.R., Lehrbach, N.J., Sapetschnig, A., Buhecha, H.R., Gilchrist, M.J., Howe, K.L., Stark, R., Matthews, N., Berezikov, E., Ketting, R.F., Tavaré, S. and Miska E.A. 2008. Piwi and piRNAs Act Upstream of an Endogenous siRNA Pathway to Suppress Tc3 Transposon Mobility in the Caenorhabditis elegans Germline. Mol Cell 31: 79-90.
3. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.
4. Georgantas III, R.W., Hildreth, R., Morisot, S., Alder, J., Liu, C.G., Heimfeld, S., Calin, G.A., Croce, C.M. and Civin, C.I. 2007. CD34+ hematopoietic stem-progenitor cell microRNA expression and function: A circuit diagram of differentiation control. PNAS 104: 2750-2755.
5. Chotkowskia, H.L., Ciotab, A.T., Jiab, Y., Puig-Basagoitic, F., Kramerb, L.D., Shic, P.Y. and Glaser, R.L. 2008. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology 377: 197-206.
6. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.
7. Tamura, Y., Yoshida, M., Ohnishi, Y. and Hohjoh, H. 2008. Variation of gene silencing involving endogenous microRNA in mammalian cells. Mol Biol Rep, epub.
8. Hammond,S.M., Boettcher, S., Caudy, A.A., Kobayashi, R. and Hannon, G.J. 2001. Argonaute2, a Link Between Genetic and Biochemical Analyses of RNAi. Science 293: 1146-1150.
9. Zhanga, Y., Yanga, H., Xiaoa, B., Wub, M., Zhoua, W., Lia, J., Lib, G. and Christados, P. 2008. Dendritic cells transduced with lentiviral-mediated RelB-specific ShRNAs inhibit the development of experimental autoimmune myasthenia gravis. Mol Imunol, epub.